核酸適體識(shí)別熒光法檢測(cè)汞離子.pdf

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1、第4O卷分析化學(xué)(FENXIHUAXUE)研究報(bào)告第12期2012年l2月ChineseJournalofAnalyticalChemistry1827～1831DOI：10．3724／SP．J．1096．2012．20127核酸適體識(shí)別熒光法檢測(cè)汞離子雷兆靜l，張存政胡秋輝劉媛張強(qiáng)劉賢金(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京210095)(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全檢測(cè)研究所，江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室一省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210014)摘要通過(guò)對(duì)已

2、知的Ni適體的改造，發(fā)現(xiàn)了對(duì)Hg2有較強(qiáng)結(jié)合活性的核酸適體N1，基于N1的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，獲得了具有較高活性的核酸適體N5，并建立了熒光檢測(cè)方法。以熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記核酸適體，在94℃變性5min，室溫(25℃)下復(fù)性30rain后，適配體與標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)DABCYL的～段互補(bǔ)序列Q2結(jié)合(適體與Q2的濃度比為1：3)，加入系列濃度的H與互補(bǔ)序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合核酸適體，以熒光信號(hào)的變化定量分析Hg濃度。結(jié)果表明，N1與Hg結(jié)合呈線性，線性范圍為1．25~20rag／L；檢出限為O．62mg／L；以Nl結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)

3、改造合成的序列和結(jié)構(gòu)均不同的適體N4，N5，N6，N7對(duì)Hg的識(shí)別結(jié)合活性均不同，其中適體N5與Hg結(jié)合活性最為靈敏，特異性高，線性范圍為0．156~2．50mg／L；檢出限為78g／L。關(guān)鍵詞核酸適體；熒光；汞離子；檢測(cè)1引言重金屬元素的定性與定量檢測(cè)在環(huán)境監(jiān)測(cè)、廢棄物管理、發(fā)育生物學(xué)及臨床毒理學(xué)等領(lǐng)域中具有很大的應(yīng)用價(jià)值，而目前重金屬元素的檢測(cè)主要采用光譜法，包括原子吸收光譜】、原子發(fā)射光譜法閉、電感耦合等離子體質(zhì)譜法嘲以及電化學(xué)法等方法。但這些方法依賴于大型儀器和專人操作，并且需要繁瑣的樣品預(yù)處理和濃縮過(guò)

4、程，在現(xiàn)場(chǎng)和野外檢測(cè)中受到限制。因此研究無(wú)污染、簡(jiǎn)便快速、高靈敏度和高特異性的方法進(jìn)行微量金屬離子的檢測(cè)十分必要。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展以及核酸適體的篩選應(yīng)用，特別是SELEX技術(shù)的應(yīng)用，已經(jīng)獲得對(duì)金屬離子(如ca2，Zn2+，Ni等)具有活性的核酸適體，以及基于核酸適體所建立的各種檢測(cè)方法0】，包括熒光法、電化學(xué)法和比色法等。本研究利用已公開發(fā)表的金屬離子適體進(jìn)行改造應(yīng)用，建立更加簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)Ni的RNA適體進(jìn)行改造，期望獲得兩條原本針對(duì)Ni起作用的DNA適體，即DNA1一B(N1

5、)。但實(shí)驗(yàn)表明，N1對(duì)Nj不起作用，對(duì)Hg卻有較強(qiáng)的結(jié)合作用嘲。核酸適體標(biāo)記有熒光基團(tuán)FAM，再與標(biāo)記有熒光猝滅基團(tuán)DABCYL的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，通過(guò)加入Hg與互補(bǔ)序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適體而引起的熒光信號(hào)變化，可定量分析Hg+[J。據(jù)此可設(shè)計(jì)出多種寡核苷酸的Hg檢測(cè)方法，如熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換法”】、膠體金檢測(cè)法[14】、熒光染料法”】；但均是采用核苷酸鏈中的胸腺嘧啶(T)可與汞配位的原理構(gòu)筑器件，其核苷酸一級(jí)序列單一，二級(jí)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單甚至無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)。本研究表明，與Hg有作用的適體N1與此前所使用的多數(shù)適體結(jié)構(gòu)不同；對(duì)Nl序列和

6、結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，得到與Hg作用更靈敏的新適體N5。本方法只需將樣品簡(jiǎn)單處理直接加樣反應(yīng)即可，且樣品用量少，適用于實(shí)際樣品中Hg的檢測(cè)。2實(shí)驗(yàn)部分2．1儀器與試劑多功能微孔板分析儀(BertholdLB940)；黑色96微孔板(Costar)。HgCI2標(biāo)準(zhǔn)溶液，緩沖液A：50mmol／LNaC1，7mmol／LMgCI2，50mmol／LTris／HC1，pH7．5。所用試劑均為分析純，實(shí)用水為二次蒸201~03-15收稿；2O12_O6_18接受本文系江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項(xiàng)目(No．CX(10)236)、蘇州

7、市科技支撐項(xiàng)目(No．SN201129)、中國(guó)博士后基金(No．20090451177)、江蘇省博士后科研資助計(jì)劃(No．0802023B)資助項(xiàng)目E-mail：jassliu@jaas．a(chǎn)c．cn分析化學(xué)第4O卷餾水。設(shè)計(jì)的DNA序列如表1所示，由上海捷瑞生物公司合成。表1合成的DNA序列Table1DNAsequenceusedinthisworkDNAM童：DNA卜BFAM-AUAGUCAGGGAACAUGACAAACACAGGGACUUGCGAAAAUCAGUGI兀兀兀GNl(Number1)FAMGG

8、ACAGGGACTTGCGGCAAATCAGTCCGN4FAM—GGACAGGGACTTTTTTTTTTTTAGTCCN5FAM-GGACAGGGACTTTCTTCTTGTTAGTCCN6FAM—GGACAGGGACTTTTTCCCCTTTTAGTCC，N7FAM—GGACAGGGACTTTTTGGGGTTTTAGTCC4GGAc，一Q1一BATGTTCCCTGACTAT—DABCYL