雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)

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1、雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)摘要：目的評(píng)價(jià)雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法性能。方法配制雙縮脲試劑，并用所配雙縮脲試劑和標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)、回收試驗(yàn)、線性范圍測(cè)定。結(jié)果雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV%為6.42，回收試驗(yàn)平均回收率為109.3%，線性范圍測(cè)定的R2為0.9877。結(jié)論雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的性能不高，本人測(cè)得的批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)CV%偏大，回收率偏高，線性范圍一般，或許這是個(gè)人操作因數(shù)，因?yàn)檫€有其他同學(xué)的結(jié)果比較好的。關(guān)鍵詞：雙縮脲法；血清總蛋白；方法學(xué)評(píng)價(jià)雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白至今已經(jīng)

2、有近100年的歷史，其間該方法也得到不斷改進(jìn)，是目前測(cè)定血清總蛋白的常用方法之一?！度珖?guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》推薦Doumas雙縮脲配方作為血清總蛋白測(cè)定的常規(guī)方法[1]。方法學(xué)評(píng)價(jià)對(duì)于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)學(xué)生日后在工作中評(píng)價(jià)檢驗(yàn)方法非常重要，對(duì)培養(yǎng)學(xué)生邏輯思維和實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制具有重要作用。本文介紹雙縮脲法測(cè)定血清總蛋白的方法學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)學(xué)生練習(xí)和掌握方法學(xué)評(píng)價(jià)有重要意義。雙縮脲試劑鑒定蛋白質(zhì)的原理：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180℃左右加熱，放出一個(gè)分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與二價(jià)銅離子形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。

3、凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵，或能過(guò)一個(gè)中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此，也能在堿性環(huán)境中與二價(jià)銅離子結(jié)合生成紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)不需要加熱，被用來(lái)定性鑒定蛋白質(zhì)。但請(qǐng)注意：凡含有2個(gè)以上肽鍵的物質(zhì)或含有1個(gè)肽鍵和1個(gè)一CS—NH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基團(tuán)的物質(zhì)，以及乙二酰乙二胺都有此顏色反應(yīng)。因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽均有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽[2]。9紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與

4、蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān)，故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。干擾這一測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差，不適合微量蛋白的測(cè)定。1.儀器與試劑1.1儀器721型分光光度計(jì)；水浴箱。1.2試劑牛血清白蛋白；硫酸銅結(jié)晶(CuSO4?5H2O)；酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6?4H2O)；氫氧化鈉(NaOH)；碘化鉀(KI)；蒸餾水。2.雙縮脲的配制2.1稱取6gNaOH溶于新鮮制備的25ml蒸餾水中，配成6mol/L氫氧化鈉溶液。稱取0.75g硫酸

5、銅，2.25g酒石酸鉀鈉，1.25g碘化鉀依次溶解于125ml蒸餾水中．在攪拌下加人6mol/L氫氧化鈉溶液25ml，用蒸餾水定容至250ml。配好的雙縮脲試劑應(yīng)貯存于塑料瓶中(或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長(zhǎng)期保存，若瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)則衙重配。2.2通常加入碘化鉀可以防止銅離子自動(dòng)還原形成一價(jià)氧化銅沉淀。在配制雙縮脲試劑過(guò)程中，進(jìn)行兩種不同加試劑順序，如下順序1：硫酸銅→酒石酸鉀鈉→碘化鉀→氫氧化鈉順序2：硫酸銅→碘化鉀→酒石酸鉀鈉→氫氧化鈉這兩種順序的區(qū)別是加酒石酸鉀鈉和加碘化鉀的順序不同，“順序1”在加完酒石酸鉀鈉后溶液是青藍(lán)色的(如

6、圖1左)，“順序2”在加完碘化鉀后溶液顏色是褐色的(如圖1右)，但兩種順序在加完所有試劑后，顏色都是相同的，都為深藍(lán)色，如圖2。這兩種不同加試劑順序的配制方法，雖然過(guò)程不同，過(guò)程中顏色變化也不同，但最后的結(jié)果是相同的。9圖1(左為先加酒石酸鉀鈉)圖2(左為先加酒石酸鉀鈉)3.批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)3.1材料待測(cè)樣品、雙縮脲試劑、蒸餾水、721型分光光度計(jì)、水浴箱3.2方法3.2.1取21支試管放試管架，分別標(biāo)記空白管1支，重復(fù)測(cè)定管20支，按表1添加試劑。表1試劑添加加人物(ml)試劑空白管測(cè)定管×20蒸餾水0.06—待測(cè)樣品—0.06雙縮脲試劑333

7、.2.2渦旋混勻后，37℃水浴10分鐘，在波長(zhǎng)540nm條件下比色，空白管調(diào)零，用分光光度計(jì)測(cè)定各管吸光度。3.2.3計(jì)算待測(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)差S和變異系數(shù)CV%值。3.3結(jié)果3.3.1結(jié)果記錄表220個(gè)測(cè)定管的吸光度值試管號(hào)吸光度試管號(hào)吸光度試管號(hào)吸光度試管號(hào)吸光度10.12160.12110.14160.1420.13170.123120.14170.14430.1480.128130.139180.13940.12990.12140.146190.14250.139100.125150.139200.1393.3.2批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果處理9計(jì)算

8、公式標(biāo)準(zhǔn)差，變異系數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差s=0.0086，變異系數(shù)CV%=6.423.4討論評(píng)價(jià)3.4.1批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)的CV%=6.42，CV%值比較大，