雙縮脲法測定血清總蛋白的方法學評價

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1、雙縮脲法測定血清總蛋白的方法學評價摘要：目的評價雙縮脲法測定血清總蛋白的方法性能。方法配制雙縮脲試劑，并用所配雙縮脲試劑和標準血清蛋白進行批內重復性試驗、回收試驗、線性范圍測定。結果雙縮脲法測定血清總蛋白的批內重復性試驗的變異系數(shù)CV%為6.42，回收試驗平均回收率為109.3%，線性范圍測定的R2為0.9877。結論雙縮脲法測定血清總蛋白的性能不高，本人測得的批內重復性試驗的變異系數(shù)CV%偏大，回收率偏高，線性范圍一般，或許這是個人操作因數(shù)，因為還有其他同學的結果比較好的。關鍵詞：雙縮脲法；血清總蛋白；方法學評價雙縮脲法測定血清總蛋白至今已經有近100年的歷史，其間該方法也得到不斷改

2、進，是目前測定血清總蛋白的常用方法之一?！度珖R床檢驗操作規(guī)程》推薦Doumas雙縮脲配方作為血清總蛋白測定的常規(guī)方法[1]。方法學評價對于醫(yī)學檢驗專業(yè)學生日后在工作中評價檢驗方法非常重要，對培養(yǎng)學生邏輯思維和實驗室質量控制具有重要作用。本文介紹雙縮脲法測定血清總蛋白的方法學評價，對學生練習和掌握方法學評價有重要意義。雙縮脲試劑鑒定蛋白質的原理：雙縮脲（NH2CONHCONH2）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與二價銅離子形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有

3、雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此，也能在堿性環(huán)境中與二價銅離子結合生成紫紅色絡合物。此反應不需要加熱，被用來定性鑒定蛋白質。但請注意：凡含有2個以上肽鍵的物質或含有1個肽鍵和1個一CS—NH2、一CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基團的物質，以及乙二酰乙二胺都有此顏色反應。因此，一切蛋白質或二肽以上的多肽均有雙縮脲反應，但有雙縮脲反應的物質不一定都是蛋白質或多肽[2]。9紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)

4、點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差，不適合微量蛋白的測定。1.儀器與試劑1.1儀器721型分光光度計；水浴箱。1.2試劑牛血清白蛋白；硫酸銅結晶(CuSO4?5H2O)；酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6?4H2O)；氫氧化鈉(NaOH)；碘化鉀(KI)；蒸餾水。2.雙縮脲的配制2.1稱取6gNaOH溶于新鮮制備的25ml蒸餾水中，配成6mol/L氫氧化鈉溶液。稱取0.75g硫酸銅，2.25g酒石酸鉀鈉，1.25g碘化鉀依次溶解于125ml蒸餾水中．在攪拌下加人6mol/L氫氧化鈉溶液25ml，用蒸餾水定容至250ml。配好的雙縮脲試劑應貯存于

5、塑料瓶中(或內壁涂以石蠟的瓶中)。此試劑可長期保存，若瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)則衙重配。2.2通常加入碘化鉀可以防止銅離子自動還原形成一價氧化銅沉淀。在配制雙縮脲試劑過程中，進行兩種不同加試劑順序，如下順序1：硫酸銅→酒石酸鉀鈉→碘化鉀→氫氧化鈉順序2：硫酸銅→碘化鉀→酒石酸鉀鈉→氫氧化鈉這兩種順序的區(qū)別是加酒石酸鉀鈉和加碘化鉀的順序不同，“順序1”在加完酒石酸鉀鈉后溶液是青藍色的(如圖1左)，“順序2”在加完碘化鉀后溶液顏色是褐色的(如圖1右)，但兩種順序在加完所有試劑后，顏色都是相同的，都為深藍色，如圖2。這兩種不同加試劑順序的配制方法，雖然過程不同，過程中顏色變化也不同，但最后的結果是

6、相同的。9圖1(左為先加酒石酸鉀鈉)圖2(左為先加酒石酸鉀鈉)3.批內重復性試驗3.1材料待測樣品、雙縮脲試劑、蒸餾水、721型分光光度計、水浴箱3.2方法3.2.1取21支試管放試管架，分別標記空白管1支，重復測定管20支，按表1添加試劑。表1試劑添加加人物(ml)試劑空白管測定管×20蒸餾水0.06—待測樣品—0.06雙縮脲試劑333.2.2渦旋混勻后，37℃水浴10分鐘，在波長540nm條件下比色，空白管調零，用分光光度計測定各管吸光度。3.2.3計算待測樣品的標準差S和變異系數(shù)CV%值。3.3結果3.3.1結果記錄表220個測定管的吸光度值試管號吸光度試管號吸光度試管號吸光度試

7、管號吸光度10.12160.12110.14160.1420.13170.123120.14170.14430.1480.128130.139180.13940.12990.12140.146190.14250.139100.125150.139200.1393.3.2批內重復性試驗結果處理9計算公式標準差，變異系數(shù)標準差s=0.0086，變異系數(shù)CV%=6.423.4討論評價3.4.1批內重復性試驗測得數(shù)據(jù)的CV%=6.42，CV%值比較大，