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1、細胞的凍存和復蘇2007-07-20??????點擊:179???本文共1篇文章一、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分
2、子量小，溶解度大，易穿透細胞。二、操作步驟（一）凍存1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。4、將懸液分至凍存管中，每管1ml。5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。注意：操作時應小心，以免
3、液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。（二）復蘇1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。6、加適當培養(yǎng)基后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。三、試劑和器材器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離
4、心管、吸管、離心機等試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。細胞的傳代培養(yǎng)2007-07-20??????點擊:232???本文共1篇文章一、原理細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續(xù)生長，同時也將細胞數(shù)量擴大，就必須進行傳代（再培養(yǎng)）。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。
5、二、材料和試劑1、細胞：貼壁細胞株2、試劑：0.25％胰酶、1640培養(yǎng)基（含10％小牛血清）3、儀器和器材：倒置顯微鏡，培養(yǎng)箱、培養(yǎng)瓶、吸管、廢液缸等三、操作步驟1、將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。2、加入0.5—1ml0.25％胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10ml培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細針孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1—3分鐘。4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸
6、液，分到另外兩到三瓶中，實踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37℃下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。附：消化液配制方法：稱取0.25克胰酶蛋白酶（活力為1：250），加入100ml無Ca2、Mg2的Hank’s液溶解，濾器過濾除菌，4℃保存，用前可在37℃下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使最終濃度達0.02％。細胞培養(yǎng)技術(shù)2007-07-20??????點擊:367???本文共1篇文章細胞培養(yǎng)的一般過程一、準備工作準備工作對開展細胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作
7、的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻。二、取材在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經(jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容
8、易培養(yǎng)。取材后應立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。由組織并分離分散細胞的方法可
