細胞凍存與復蘇　

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1、細胞凍存與復蘇細胞儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時間是無限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。細胞的凍存【用品】（1）??5%胰蛋白酶（2）??含10%~20%血清培養(yǎng)液（3）??DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（15磅蒸汽高壓消毒）（4）??吸管、離心管、凍存管【步驟】（1）??從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞，已經(jīng)長滿的細胞凍存后生存率低。在凍存前一天最好換一次培養(yǎng)液。（2）??用胰蛋白酶

2、把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細胞收集于離心管并計數(shù)，離心。（3）??去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入配制好的凍存培養(yǎng)液（含10%DMSO或甘油），凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml~1×107/ml。用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后分裝入無菌凍存管中。（4）??裝完細胞后的凍存管即可直接凍存。以本教研室對L929的凍存程序作為大家進行細胞凍存的參考：將凍存管放入4℃冰箱2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面過夜。以后取出凍存管移入液氮容器內(nèi)。在放入液

3、氮時，要帶手套操作以免凍傷。細胞在液氮中儲存時間理論上是無限的，但為妥善起見，特別是很多為被凍存過的細胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復蘇一次觀察細胞對凍存的適應性。已建系的細胞最好也每年取一支復蘇一次后，再繼續(xù)凍存。細胞的復蘇【用品】培養(yǎng)液，吸管，離心管，培養(yǎng)瓶，37℃溫水【步驟】（1）??從保存凍存管的支架中取出凍存管應直接投入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。如果凍存管密封不嚴，在保存過程中液氮進入凍存管中，從液氮罐中取出時由于溫度升高導致液氮急速氣化而爆炸，可能會危及面部等。因此，存取凍存管

4、時都要佩戴眼鏡和手套。（2）??從37℃水浴中取出凍存管，用酒精消毒后，擰開凍存管，用吸管吸出細胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，在重復用培養(yǎng)液洗一次。（3）??用培養(yǎng)液適當稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，放在37℃溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。如果復蘇時細胞密度較高要及時傳代。細胞復蘇時細胞數(shù)可以做10~20倍稀釋，接種密度以5×105/ml為宜。　　　1冷凍管應如何解凍？取出冷凍管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并

5、注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。2細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時，是否應馬上去除DMSO？除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。3可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)

6、條件不同之培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。4可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。5何謂FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，F(xiàn)CS錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calfseru

7、m)則是指小牛血清。HS(horseserum)則是指馬血清。6培養(yǎng)細胞時應使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細胞培養(yǎng)時應使用的CO2濃度。當培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養(yǎng)時應使用10%CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養(yǎng)細胞。7何時須更換培養(yǎng)基？視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。8培養(yǎng)基中是

8、否須添加抗生素？　除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。9附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA濃度？應如何處理？一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20°C，避免反復冷凍解凍造成trypsin之活性降低，并可減少污染之機會。10懸浮性細胞應如何繼代處理？一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍