細胞凍存與復蘇課件.ppt

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1、暨南大學醫(yī)學院生物化學教研室費嘉細胞復蘇與凍存一、細胞凍存在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內、外環(huán)境中的水都會形成冰晶，導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、pH改變、蛋白變性等，引起細胞死亡。在培養(yǎng)液中加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）。DMSO的常用濃度為5%-10%。添加DMSO保護劑的細胞在液氮中凍存1-2年，存活率可達80%-90%。DMSO液需預先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞。試劑和器材器材：液氮罐、凍存管（

2、塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶，2ml）、離心管、吸管、離心機等試劑：含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）操作步驟：1、消化細胞，收集細胞懸液。2、離心，1000rpm10min，棄上清液。3、沉淀加凍存液，計數(shù)，調整至5×106/ml左右。4、將懸液分至凍存管中，每管1ml。5、封口6、標注標明細胞種類、凍存日期。7、梯度降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮注：本室降溫程序：室溫→4℃30分鐘→冰水中10分鐘→－20℃30分鐘→－80℃過夜→液氮注意事項：1、凍存

3、細胞的活力95%以上2、避免凍傷3、避免液氮揮發(fā)干凈4、新復蘇的細胞在72小時里最好不要更換培養(yǎng)基，或傳代。5、?新引進的細胞株，應首先做好凍存?zhèn)溆?。二、細胞復蘇復蘇原則：速融-----凍存細胞的復蘇以急速融化為原則，使培養(yǎng)物能快速通過對細胞有損害的-5～0℃攝氏度區(qū)域，細胞仍能生長，活力受損不大。操作步驟:一、準備工作1、37℃水浴2、準備一個內裝5-10ml細胞完全培養(yǎng)基離心管，溫度=25℃。二、復蘇1、從液氮中取出凍存管、迅速置于37℃水浴中，1分鐘。2、打開凍存管，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。3、1000rpm離心1

4、0min，棄去上清液。4、沉淀中加入適當培養(yǎng)基，37℃常規(guī)培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。細胞復蘇注意事項防止凍存管在水浴中融化時爆炸----遠離----勿拆除包裝布袋，佩戴防護眼鏡、口罩?？焖偃诨?，并迅速去除凍存液。五、細胞運輸1.長距離運輸（幾天）2.短距離運輸（幾小時）3.細胞懸液空運4.液氮凍存運輸四、血清滅活目的：去除血清中的補體成分，避免補體對細胞產生毒性作用。方法：56℃30min注意事項：血清溶解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻，才不會使產品質量受損。步驟：-20℃2-8℃部分溶解室溫下全部溶解56℃水浴熱滅活30min