基因診斷與基因治療課件

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1、1第二十一章基因診斷與基因治療GeneticDiagnosisandGeneTherapy2基因變異致病類型內(nèi)源基因的變異基因結(jié)構(gòu)突變基因表達(dá)異常外源基因的入侵3第一節(jié)基因診斷概念和特點(diǎn)基因診斷的常用技術(shù)方法基因診斷的應(yīng)用4一、基因診斷的概念和特點(diǎn)概念利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對疾病作出診斷的方法。5特點(diǎn)針對性強(qiáng)特異性高靈敏度高適用性強(qiáng)，診斷范圍廣6二、基因診斷的常用技術(shù)方法核酸分子雜交技術(shù)1.限制性內(nèi)切酶酶譜分析法2.DNA限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，R

2、FLP）分析3.等位基因特異寡核苷酸探針（allelespecificoligonucleotide，ASO）雜交法聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基因測序基因芯片7（一）核酸分子雜交技術(shù)來源不同、具有互補(bǔ)堿基序列的核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜條件下互補(bǔ)配對形成雜化雙鏈結(jié)構(gòu)。選用已知順序片段作為探針，經(jīng)放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記后，再與未知的目的核酸鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)。分離已雜交和未雜交的標(biāo)記核酸片段，通過標(biāo)記信號的檢測對未知的目的核酸鏈進(jìn)行定性、定量分析。8×MstⅡ酶切位點(diǎn)(GCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分

3、析9+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因組的限制性酶切分析10RLFP分析法113.等位基因特異寡核苷酸探針(allelespecificoligonucleotide,ASO)雜交法當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成ASO用同位素或非同位素標(biāo)記進(jìn)行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點(diǎn)突變時一般需要合成兩種探針，一種是野生型探針，與無突變序列互補(bǔ)雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種是突變型探針，只與突變基因序列穩(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來.12ASO雜交法ATACGTGC正常ASO

4、突變ASO基因型:+/++/--/-雜交:++++++基因型:+/++/--/-雜交:++++++13（二）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）直接采用PCR技術(shù)進(jìn)行基因診斷；常與其它技術(shù)如分子雜交、限制酶酶譜分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測、限制性片段長度多態(tài)性分析、DNA序列測定等聯(lián)合應(yīng)用。PCR-RFLPPCR-SSCP14PCR/單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正常基因和變異基因的遷移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。15正常人純合突變雜合突變Leber病患者PCR/SSCP分析

5、+﹣16（三）基因測序基因測序是進(jìn)行基因突變檢測的最直接、最準(zhǔn)確的方法；可確定突變的部位和性質(zhì)；由于技術(shù)原因，目前尚難以直接在臨床上應(yīng)用。17DNA診斷：以DNA為檢測對象，探測DNA序列中的突變情況；RNA診斷：以mRNA為檢測對象的診斷方法；常用的有RNA點(diǎn)雜交、Northern分析和定量逆轉(zhuǎn)錄PCR等。18（四）基因芯片近年來興起的基因分析與檢測的新技術(shù)，具有快速、敏感、高效、平行化、自動化等優(yōu)點(diǎn)，將發(fā)展成新一代基因診斷技術(shù)；可檢測基因的結(jié)構(gòu)及其突變、多態(tài)性，分析基因的表達(dá)情況；按照基因芯片的用途將其分為表達(dá)譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片、毒理芯片等。19三、基因診

6、斷的應(yīng)用遺傳疾病腫瘤感染性疾病，傳染性流行病判斷個體疾病易感性器官移植組織配型法醫(yī)學(xué)中個體識別、親子鑒定20第二節(jié)基因治療概念和方法基因治療的基本程序基因治療的應(yīng)用與展望21定義早期是指用正常的基因整合入細(xì)胞基因組，以校正和置換致病基因的一種治療方法。目前廣義上來講是指將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，以達(dá)到治療疾病目的的方法。一、基因治療的概念22基因治療的方法基因矯正(genecorrection)基因置換(genereplacement)基因增補(bǔ)(geneaugmentation)基因失活(geneinactivation)23幾種常見的基因失活技術(shù)反義核酸

7、技術(shù)核酶技術(shù)三鏈技術(shù)干擾RNA(RNAi)技術(shù)基因治療的其他方法：如“自殺基因”的應(yīng)用，基因疫苗等24自殺基因可產(chǎn)生細(xì)胞自殺效應(yīng)將“自殺基因”轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺效應(yīng)”，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。25二、基因治療的基本程序治療性基因的選擇基因載體的選擇靶細(xì)胞的選擇基因轉(zhuǎn)移外源基因表達(dá)的篩選利用在體中的標(biāo)記基因回輸體內(nèi)病毒載體非病毒載體體細(xì)胞生殖細(xì)胞間接體內(nèi)療法直接體內(nèi)療法26間接體內(nèi)療法直接