實(shí)驗(yàn)十一紫外誘變技術(shù)及抗藥性突變菌株的篩選

《實(shí)驗(yàn)十一紫外誘變技術(shù)及抗藥性突變菌株的篩選》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。

1、實(shí)驗(yàn)十一紫外誘變技術(shù)及抗藥性突變菌株的篩選?、?紫外誘變技術(shù)　　一實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹　∫宰贤饩€處理細(xì)菌細(xì)胞為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本技術(shù)。了解紫外線對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的作用?！　《?shí)驗(yàn)材料和用具　　　菌株：大腸桿菌（Escherichiacoli）　培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯（nutrientbroth）固體和液體培養(yǎng)基　生理鹽水等　器皿：10ml及1ml的移液管，無(wú)菌試管，無(wú)菌培養(yǎng)皿，無(wú)菌三角瓶（內(nèi)有無(wú)菌的玻璃珠20~40粒），無(wú)菌漏斗（內(nèi)有兩層擦鏡紙），無(wú)菌離心管，離心機(jī)，紫外誘變箱等?！∪龑?shí)驗(yàn)原理　　以微生物的自然變易作為基礎(chǔ)的篩選菌種的機(jī)率并不很高。因?yàn)樽园l(fā)突變率小，一個(gè)基因的自發(fā)突變率僅為10-

2、6~10-10左右。為了加大突變頻率，可采用物理或化學(xué)的因素進(jìn)行誘發(fā)突變。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV誘變一般采用15w的紫外滅菌燈，其光譜比較集中在253.7nm處，這與DNA的吸收波長(zhǎng)一致，可引起DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，特別是嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，從而引起菌種的遺傳特性發(fā)生變易。在生產(chǎn)和科研中可利用此法獲得突變株?！　∷膶?shí)驗(yàn)內(nèi)容　1、對(duì)出發(fā)菌株進(jìn)行處理，制備單細(xì)胞懸液；　2、紫外線進(jìn)行處理；　3、用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定致死率；　　　五操作步驟　　　（一）出發(fā)菌株菌懸液的制備　　　1.出發(fā)菌株移接新鮮斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16~24h；　　　2.將活化后的菌株

3、接種于液體培養(yǎng)基，37℃110rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜（約16h），第二天，以20~30%接種量轉(zhuǎn)接新鮮的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2~4h；　　　3.取4ml培養(yǎng)液與5ml離心管中，10000rpm離心3~5min，棄去上清液，加4ml無(wú)菌生理鹽水，重新懸浮菌體，再離心，棄去上清，重復(fù)上述步驟用生理鹽水恢復(fù)成菌懸液；　4.將上述菌懸液倒入裝有小玻璃珠的無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，振蕩20~30min，以打散細(xì)胞；　　5.取誘變前的0.5ml菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋分離，取三個(gè)合適的稀釋度傾注肉湯平板，每一梯度傾注兩皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培養(yǎng)24~36h，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)?！　　。ǘ︰V誘變　　1.

4、將紫外燈打開，預(yù)熱30min；　　　2.取直徑6cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿（含轉(zhuǎn)子），加入菌懸液5ml，控制細(xì)胞密度為107~108個(gè)/ml；　　3.將待處理的培養(yǎng)皿置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌儀上，靜止1分鐘后開啟磁力攪拌儀旋紐進(jìn)行攪拌，然后打開皿蓋，分別處理5s、10s、15s、30s、45s，照射完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉攪拌和紫外燈；　　　4.取0.5ml處理后的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋分離，取三個(gè)合適的稀釋度傾注肉湯平板進(jìn)行計(jì)數(shù)（避光培養(yǎng)）?！×鶎?shí)驗(yàn)結(jié)果　　對(duì)平板菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算死亡率?！「戒洠簩?shí)驗(yàn)流程圖　出發(fā)菌株　↓　斜面活化　　↓37℃，16~24hr　振蕩培養(yǎng)　↓37℃，110rpm過(guò)夜　

5、翻接　　↓37℃，110rpm2~4hr　　取4ml離心收集菌體　　　↓10000rpm,5min　　棄上清液　↓　　　懸浮沉淀于4ml無(wú)菌生理鹽水　　離心　　↓10000rpm,5min　棄上清液　↓　　　懸浮沉淀于4ml無(wú)菌生理鹽水　↓　離心　　↓10000rpm,5min　　　棄上清液　　　↓　　懸浮沉淀于4ml無(wú)菌生理鹽水　　　↓　玻璃珠振蕩　↓20~30min　　　單細(xì)胞菌懸液→平板菌落計(jì)數(shù)　　↓UV誘變　　　平板菌落計(jì)數(shù)?、?鏈霉素抗性突變株的篩選　　一實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹∫宰贤饩€誘變獲得大腸桿菌的鏈霉素抗性突變株為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本技術(shù)?！　《?shí)驗(yàn)材料和用具　菌種：大腸

6、桿菌E.coli　　培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂+Str、生理鹽水等　鏈霉素溶液：母液2mg/ml；終濃度8mg/ml　　儀器：紫外誘變箱、超凈工作臺(tái)、紅燈、鐵筒、離心機(jī)、混合儀等　　三實(shí)驗(yàn)原理　鏈霉素屬氮基糖昔類抗生素。細(xì)菌對(duì)氨基糖昔類抗生素產(chǎn)生耐藥性的作用機(jī)理主要有以下幾種:其一，細(xì)菌產(chǎn)生相應(yīng)的鈍化酶對(duì)進(jìn)人胞內(nèi)的活性分子進(jìn)行修飾，令其失去生物活性；其二，氨基糖昔類抗生素的作用靶位核搪體或是與核糖體結(jié)合的核蛋白的氨基酸發(fā)生突變而使進(jìn)人胞內(nèi)的該類抗生素不能與之結(jié)合或結(jié)合力下降；其它機(jī)理，包括細(xì)胞膜的通透性下降等。細(xì)菌對(duì)鏈霉素產(chǎn)生抗藥性的作用機(jī)理屬于第二種。鏈霉素抗性是由于編碼

7、核糖體蛋白S12的rpsL基因或其它基因發(fā)生突變導(dǎo)致核糖體或核糖體蛋自發(fā)生改變而產(chǎn)生。　　四操作步驟　　　1.出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接營(yíng)養(yǎng)肉湯斜面活化；　　　2.菌株的培養(yǎng)、細(xì)胞的收集和離心、紫外誘變處理同實(shí)驗(yàn)二；　3.將誘變前、后的菌懸液各取0.5ml，進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尫蛛x，然后用傾注法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)；并選擇誘變處理前合適濃度的菌懸液涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂+Str平板（Str終濃度8mg/ml），培養(yǎng)后記錄抗性菌落數(shù)，計(jì)算該菌的自發(fā)突變率；　4.另取1ml誘變處理好的菌懸液接