實驗十一 紫外誘變技術(shù)及抗藥性突變菌株的篩選

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1、實驗十一紫外誘變技術(shù)及抗藥性突變菌株的篩選Ⅰ.紫外誘變技術(shù)一實驗?zāi)康囊宰贤饩€處理細(xì)菌細(xì)胞為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本技術(shù)。了解紫外線對細(xì)菌細(xì)胞的作用。二實驗材料和用具菌株：大腸桿菌（Escherichiacoli）培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯（nutrientbroth）固體和液體培養(yǎng)基生理鹽水等器皿：10ml及1ml的移液管，無菌試管，無菌培養(yǎng)皿，無菌三角瓶（內(nèi)有無菌的玻璃珠20~40粒），無菌漏斗（內(nèi)有兩層擦鏡紙），無菌離心管，離心機(jī)，紫外誘變箱等。三實驗原理以微生物的自然變易作為基礎(chǔ)的篩選菌種的機(jī)率并不

2、很高。因為自發(fā)突變率小，一個基因的自發(fā)突變率僅為10-6~10-10左右。為了加大突變頻率，可采用物理或化學(xué)的因素進(jìn)行誘發(fā)突變。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV誘變一般采用15w的紫外滅菌燈，其光譜比較集中在253.7nm處，這與DNA的吸收波長一致，可引起DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，特別是嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，從而引起菌種的遺傳特性發(fā)生變易。在生產(chǎn)和科研中可利用此法獲得突變株。四實驗內(nèi)容1、對出發(fā)菌株進(jìn)行處理，制備單細(xì)胞懸液；2、紫外線進(jìn)行處理；3、用平板菌落計數(shù)法測定致死率；五操

3、作步驟（一）出發(fā)菌株菌懸液的制備1.出發(fā)菌株移接新鮮斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16~24h；2.將活化后的菌株接種于液體培養(yǎng)基，37℃110rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約16h），第二天，以20~30%接種量轉(zhuǎn)接新鮮的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2~4h；3.取4ml培養(yǎng)液與5ml離心管中，10000rpm離心3~5min，棄去上清液，加4ml無菌生理鹽水，重新懸浮菌體，再離心，棄去上清，重復(fù)上述步驟用生理鹽水恢復(fù)成菌懸液；4.將上述菌懸液倒入裝有小玻璃珠的無菌三角瓶內(nèi)，振蕩20~30min，以打散細(xì)胞；5.取誘變

4、前的0.5ml菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋分離，取三個合適的稀釋度傾注肉湯平板，每一梯度傾注兩皿，每皿加1ml菌液，37℃倒置培養(yǎng)24~36h，進(jìn)行平板菌落計數(shù)。（二）UV誘變1.將紫外燈打開，預(yù)熱30min；2.取直徑6cm的無菌培養(yǎng)皿（含轉(zhuǎn)子），加入菌懸液5ml，控制細(xì)胞密度為107~108個/ml；3.將待處理的培養(yǎng)皿置于誘變箱內(nèi)的磁力攪拌儀上，靜止1分鐘后開啟磁力攪拌儀旋紐進(jìn)行攪拌，然后打開皿蓋，分別處理5s、10s、15s、30s、45s，照射完畢后先蓋上皿蓋，再關(guān)閉攪拌和紫外燈；4.取0.5ml處

5、理后的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋分離，取三個合適的稀釋度傾注肉湯平板進(jìn)行計數(shù)（避光培養(yǎng)）。六實驗結(jié)果對平板菌落進(jìn)行計數(shù)，并計算死亡率。附錄：實驗流程圖出發(fā)菌株↓斜面活化↓37℃，16~24hr振蕩培養(yǎng)↓37℃，110rpm過夜翻接↓37℃，110rpm2~4hr取4ml離心收集菌體↓10000rpm,5min棄上清液↓懸浮沉淀于4ml無菌生理鹽水離心↓10000rpm,5min棄上清液↓懸浮沉淀于4ml無菌生理鹽水↓離心↓10000rpm,5min棄上清液↓懸浮沉淀于4ml無菌生理鹽水↓玻璃珠振蕩↓20~30

6、min單細(xì)胞菌懸液→平板菌落計數(shù)↓UV誘變平板菌落計數(shù)Ⅱ.鏈霉素抗性突變株的篩選一實驗?zāi)康囊宰贤饩€誘變獲得大腸桿菌的鏈霉素抗性突變株為例，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本技術(shù)。二實驗材料和用具菌種：大腸桿菌E.coli培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)瓊脂+Str、生理鹽水等鏈霉素溶液：母液2mg/ml；終濃度8mg/ml儀器：紫外誘變箱、超凈工作臺、紅燈、鐵筒、離心機(jī)、混合儀等三實驗原理鏈霉素屬氮基糖昔類抗生素。細(xì)菌對氨基糖昔類抗生素產(chǎn)生耐藥性的作用機(jī)理主要有以下幾種:其一，細(xì)菌產(chǎn)生相應(yīng)的鈍化酶對進(jìn)人胞內(nèi)的

7、活性分子進(jìn)行修飾，令其失去生物活性；其二，氨基糖昔類抗生素的作用靶位核搪體或是與核糖體結(jié)合的核蛋白的氨基酸發(fā)生突變而使進(jìn)人胞內(nèi)的該類抗生素不能與之結(jié)合或結(jié)合力下降；其它機(jī)理，包括細(xì)胞膜的通透性下降等。細(xì)菌對鏈霉素產(chǎn)生抗藥性的作用機(jī)理屬于第二種。鏈霉素抗性是由于編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因或其它基因發(fā)生突變導(dǎo)致核糖體或核糖體蛋自發(fā)生改變而產(chǎn)生。四操作步驟1.出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接營養(yǎng)肉湯斜面活化；2.菌株的培養(yǎng)、細(xì)胞的收集和離心、紫外誘變處理同實驗二；3.將誘變前、后的菌懸液各取0.5ml，進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?/p>

8、分離，然后用傾注法進(jìn)行平板菌落計數(shù)；并選擇誘變處理前合適濃度的菌懸液涂布營養(yǎng)瓊脂+Str平板（Str終濃度8mg/ml），培養(yǎng)后記錄抗性菌落數(shù)，計算該菌的自發(fā)突變率；4.另取1ml誘變處理好的菌懸液接入液體營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基進(jìn)行后培養(yǎng)，37℃120rpm搖瓶培養(yǎng)；5.對后培養(yǎng)以后的菌懸液進(jìn)行平板菌落計數(shù)和抗性菌落數(shù)計數(shù)，觀察紫外誘變的效果。五實驗內(nèi)容1.用紫外線對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行誘變處理；2.利用藥物平板篩選抗性突變株；六實驗結(jié)果1.觀察紫外誘變的結(jié)果；2.計算大腸桿菌鏈