pcr定點(diǎn)突變應(yīng)用實(shí)例

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1、PCR定點(diǎn)突變應(yīng)用實(shí)例+T)E,~,c%Q%~!r+l.i1、PCR定點(diǎn)突變法構(gòu)建人抗菌肽FALL-39基因突變體，并比較研究FALL-39及其突變肽的功能：方法：應(yīng)用RT-PCR從人肺腺上皮細(xì)胞株SPC-A-1總RNA中擴(kuò)增FALL-39成熟肽cDNA，以pGEX-1λT為載體，構(gòu)建抗菌肽FALL-39基因大腸桿菌表達(dá)載體；采用一步法和兩步法PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)，用賴氨酸替代第24位的谷氨酰胺和／或第32位的天門冬氨酸，構(gòu)建FALL-39突變體大腸桿菌表達(dá)載體；該載體表達(dá)的融合蛋白經(jīng)親合層析、凝血酶酶切、膠回收和高效液相色譜分離純化，獲得高度純化的重組FALL-39以及突變肽；對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)

2、行的：MEC、MIC、MBC和溶血性實(shí)驗(yàn)等比較抗菌作用以及對(duì)紅細(xì)胞膜的溶解性，用RT-PCR測(cè)定人單核巨噬細(xì)胞株THP-1：iNOS的表達(dá)，研究FALL-39及其突變肽的抗內(nèi)毒作用。結(jié)果：重組質(zhì)粒pGEX-1λT-FALL-39測(cè)序結(jié)果說(shuō)明其插入片段序列與GenBank登錄的FALL-39基因的cDNA序列相符，且插入方向正確；DNA測(cè)序結(jié)果表明在預(yù)期位點(diǎn)發(fā)生突變，用一步法得到突變體質(zhì)粒pGEX-λT-FALL-39-Lys32，用兩步法得到pGEX-1λT-FALL-39-Lvs24以及pGEX-λT-FALL-39-Lys24’32；重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-λT-FALL-39及其突變體

3、融合蛋白有高效表達(dá)，經(jīng)提取純化可得到高純度的活性蛋白FALL-39，F(xiàn)ALL-39-Lys24，F(xiàn)ALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24’32(約4Kd)：突變后的FALL-39蛋白對(duì)大腸桿菌ATCC25922和耐氨芐青霉素ML-35p的抗菌活性明顯增強(qiáng)，最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)值FALL-39-Lys24’32最小，其次是FALL-39-Lys32和FALL-39-Lys24，均小于FALL-39-FALL-39Lys32和FALL-39兩種蛋白均在含：MediumE的LB培養(yǎng)基中表現(xiàn)出較高活性，在LB培養(yǎng)基中抗菌活性最低，但在同一種培養(yǎng)基中FALL-39

4、-Lys32蛋白抗菌活性要高于FALL-39蛋白。突變后FALL-39蛋白在抗菌劑量時(shí)對(duì)紅細(xì)胞的溶解作用未見明顯增加，較大劑量時(shí)對(duì)紅細(xì)胞的溶解作用略有增加。突變后FALL-39-Lys32蛋白對(duì)LPS引起的iNOSmRNA的表達(dá)量增強(qiáng)抑制作用明顯。結(jié)論：用FALL-39基因大腸桿菌表達(dá)載體可得到高效表達(dá)的蛋白；用高保真的PolybestDNA多聚酶進(jìn)行一步法PCR定點(diǎn)突變技術(shù)簡(jiǎn)單、有效；突變質(zhì)粒表達(dá)分子的抗菌活性和抗內(nèi)毒素明顯增強(qiáng)，對(duì)紅細(xì)胞的溶解作用在抗菌劑量時(shí)未見明顯增加，較大劑量時(shí)略有增加，提示在FALL-39分子中增加堿性氨基酸可以增強(qiáng)其抗菌活性。――引自：《用PCR定點(diǎn)突變方法研究人抗

5、菌肽FALL-39功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系》，作者：楊云霞。)f)c2@,E1~8

6、2、基因改造中快速PCR定點(diǎn)突變方法應(yīng)用：銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)因?yàn)榭梢韵齇-?·2而被廣泛應(yīng)用于延緩衰老和控制炎癥，但是由于多種因素影響，尤其是Cu，Zn-SOD具有種質(zhì)特異性以及在體內(nèi)停留時(shí)間短(通常只有6～10min)，使得Cu，Zn-SOD的應(yīng)用受到很大限制。定點(diǎn)突變技術(shù)是改造、優(yōu)化基因常用的手段，也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間復(fù)雜關(guān)系的有效方法，在醫(yī)學(xué)上還可用于基因治療等。目前常用的定點(diǎn)突變方法有寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變、重疊延伸PCR定點(diǎn)突變及盒式突變等。但由于這些方法操作繁瑣，意外突變

7、多等缺陷，使定點(diǎn)突變的實(shí)驗(yàn)受到一定限制。本研究采用一種近年來(lái)新的定點(diǎn)突變技術(shù)—快速PCR定點(diǎn)突變方法成功地對(duì)hCu，Zn-SOD進(jìn)行了基因改良(將hCu，Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密碼子突變?yōu)锳la密碼子，以提高其穩(wěn)定性)，同時(shí)對(duì)該定點(diǎn)突變技術(shù)要點(diǎn)進(jìn)行探討。4m8I0Q)`??M8n1R1)材料#S+]2g*v&@'u　　??菌株與質(zhì)粒??E.coliDH5α，由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pESOD(含hCu，Zn-SOD基因、Ampr基因以及EcoRI酶切位點(diǎn)，整個(gè)質(zhì)粒約33kb)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，并轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α保存。7y#F#I$?"]+

8、　????主要試劑??Pfu

9、高保真DNA聚合酶(深圳晶美生物工程有限公司)；DpnI酶(河南華美生物工程有限公司);小量質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖?上海博亞生物技術(shù)有限公司);DNAMarker,T4DNA連接酶，EcoRI等常規(guī)酶(上海Sangon公司)。#[%r6d+B)N1k"~#`$W　????pESOD質(zhì)粒提取及鑒定??用質(zhì)?？焖俪樘峒兓噭┖袕暮琾ESOD質(zhì)粒的E.coliDH5α轉(zhuǎn)化菌里提取pESOD質(zhì)粒，取部分質(zhì)