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《擴(kuò)展青霉脂肪酶定點(diǎn)突變隨機(jī)突變易錯(cuò)pcr碩士論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、擴(kuò)展青霉脂肪酶熱穩(wěn)定性的分子突變【關(guān)鍵詞】擴(kuò)展青霉脂肪酶;定點(diǎn)突變;隨機(jī)突變;易錯(cuò)PCR;【英文關(guān)鍵詞】Penicillumexpaasumlipase;Site-directedmutagenesis;Randommutagenesis;error-pronePCR;【中文摘要】本研究利用定點(diǎn)突變和隨機(jī)突變的方法,對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶(Penicilliumexpansumlipase,PEL)進(jìn)行了蛋白質(zhì)工程改造。1.PEL的定點(diǎn)突變采用重疊延伸PCR的方法,對(duì)擴(kuò)展青霉脂肪酶進(jìn)行多個(gè)點(diǎn)突變,選取了十一個(gè)突變位點(diǎn)
2、,構(gòu)建了7個(gè)單點(diǎn)突變體和8個(gè)疊加突變體(與隨機(jī)突變體ep8疊加)。將獲得的突變基因在畢赤酵母中表達(dá),并進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究。(1)P197E的單點(diǎn)突變及疊加突變：PEL-P197E酶活為556U/mL,Tm值比野生型提高了0.90C。PEL-ep8-P197E酶活為592U/mL,其Tm值比野生型脂肪酶PEL的提高2.80C,比隨機(jī)突變體PEL-ep8提高2.2℃；此外,疊加突變體PEL-ep8-P197E的底物特異性發(fā)生了改變。(2)K152R的單點(diǎn)突變及疊加突變：PEL-K152R酶活為530U/mL,PEL
3、-ep8-K152R酶活為416U/mL,二者的熱穩(wěn)定性與與野生型無(wú)明顯差別。(3)P102L的單點(diǎn)突變及疊加突變：PEL-P102L酶活為300U/mL。PEL-ep8-P102L的酶活為612U/mL,最適作用溫度提高了50...【英文摘要】InordertoimprovetheenzymepropertiesofthePenicillumexpaasumlipase(PEL),thePELgenewasmutatedbysite-mutagenesisandrandommutagenesis.1.Site
4、-directedmutagenesisofPELInordertoimprovethethermostabilityofPenicilliumexpansumlipase(PEL),Elevenmutationswerecreatedbysite-directedmutagenesis.MutationsweregeneratedbyoverlapextensionPCRusingthecDNAofwild-typelipasegene(lip07)orasinglesitemutantlipaseep8as
5、thetemplateandtwospecialprimersthatcorresp...摘要2-4Abstract4-6中文文摘7-13第一章緒論13-351理性設(shè)計(jì)14-152非理性設(shè)計(jì)15-342.2突變體庫(kù)的構(gòu)建策略16-292.2.1基于PCR而實(shí)現(xiàn)的隨機(jī)突變16-192.2.2基于同源重組而實(shí)現(xiàn)的隨機(jī)突變19-272.2.3基于非同源重組而實(shí)現(xiàn)的隨機(jī)突變27-292.3定向進(jìn)化篩選策略29-342.3.1表型觀察選擇和篩選29-302.3.2微孔板滴定法30-312.3.3各種展示技術(shù)31-343半
6、理性設(shè)計(jì)34-35第二章材料與方法35-511實(shí)驗(yàn)材料35-381.1菌種和質(zhì)粒351.2酶與試劑351.3常用培養(yǎng)基及緩沖液35-371.4寡核苷酸引物37-381.5常用儀器382實(shí)驗(yàn)方法38-512.1擴(kuò)展青霉脂肪酶的定點(diǎn)突變38-472.1.1P197E、K152R、P102L、N166D的單點(diǎn)突變及疊加突變38-442.1.2P163A、M193V、K120R的疊加突變44-462.1.3G205A、K94R、W169N、K94D的單點(diǎn)突變46-472.2擴(kuò)展青霉脂肪酶的隨機(jī)突變47-512.2.1突
7、變體庫(kù)的獲得47-482.2.2隨機(jī)突變基因表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)482.2.3酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定48-492.2.4突變體脂肪酶基因的序列測(cè)定49-51第三章結(jié)果與分析51-831.PEL的定點(diǎn)突變51-781.1突變點(diǎn)的選擇51-521.2P197E的單點(diǎn)突變及疊加突變52-581.3K152R的單點(diǎn)突變及疊加突變58-641.4P102L的單點(diǎn)突變及疊加突變64-671.5N166D的單點(diǎn)突變及疊加突變67-711.6P163A的疊加突變71-731.7K120R、M193V的疊加突變73-761.8G205A
8、、K94R、K94D、W169N的單點(diǎn)突變76-782PEL的隨機(jī)突變78-832.1隨機(jī)突變基因的獲得78-792.2表達(dá)質(zhì)粒庫(kù)的構(gòu)建及在畢赤酵母中的表達(dá)79-802.3突變體的酶學(xué)性質(zhì)80-822.4突變體核苷酸序列測(cè)定82-83第四章小結(jié)與討論83-891PEL的定點(diǎn)突變83-862PEL的隨機(jī)突變86-89結(jié)論89-931定點(diǎn)突變89-902隨機(jī)突變90-93參考文獻(xiàn)
