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《擴展青霉堿性脂肪酶基因的表達及分子突變》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、福建師范大學碩士學位論文擴展青霉堿性脂肪酶基因的表達及分子突變姓名：袁彩申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：林琳2003.4.1擴碰青霉堿性黼舫酶基粥的表述及分子突變內(nèi)容提要本文報道了擴艘靜霉堿性脂肪酶(PEL)基因在也撕德畢券酵母中的表達及利朋蛋自袋。l：程改選PEL蒸因瓣騷究二￡僚。一、PEL基因在巴斯德畢赤酵母中的淡達，實現(xiàn)了擴展青霉堿憔脂肪酶基因巍畢赤酵母中的贏效表達。f襲選蟹自PEL-GS分泌至臻算基串，努予爨約28kD，鳥PEL夫棗穩(wěn)讖，占分泌蛩角熬95％。翊不添加YNB、生物素及初貽pH7．0的培養(yǎng)熬，每24h添加1．5％甲醇誘導，進行重組酵母培養(yǎng)，培養(yǎng)7
2、2h發(fā)酵液酶活達260U／ml。j一一百“，二、PEL基舜熬定煮突變f定點突變獲得突變蒸因PEL．P163A、PEL．D92L．井在畢赤酵母中表達。《突變體P163A襲達蛋白PEL．P163A．GS晟適反應溫度為25℃，比PEL．GS降低了15"C；岡瓣對熱敏感、對蛋自瓣不敏感。較甄激發(fā)(25℃)培糞瓣PEL,-GS、PEL-P163A-GS戇表達均肖促進作用，其對PEL-P163A寢達影響尤為髭著，GSopPIC3．5K-PEL25"C培養(yǎng)96h，上消酶活是28℃培養(yǎng)的2．3倍，25"C、初始pH7．35條件。F熔養(yǎng)72h，其酶活達270U／ml；GS-pPIC3。5K．PEL在檁網(wǎng)條
3、fFF培養(yǎng)96h，酶活選380U／ml。突變體D92L．襲這蛋鑫量大大下酶，28"(2；秘娥pH7。35條嘏二’F培養(yǎng)72h，主渣酶洼為20U／ml，僅為PEL-GS的7％。A——、》一一三、PEL基因的隨機誘變翔弱錯PCR火腸桿菌，獲得與pPlC3．5K連接，轉(zhuǎn)能平板篩蹦適于低溫或?qū)岱€(wěn)定的煎組子，篩選獲得一株最活殷鹿溫度、熱穩(wěn)定性、發(fā)酵酶活均有提高的突交蔣PEL-ep5-GS，其簸活爰癱溫度為45"C，}￡舅生蘩菇窶5℃；40℃憝毽30rain殘留活性為56％，大大高于野生型的6％；初始pH7．3528℃條件-卜培養(yǎng)72h，發(fā)酵上黼．gJ325U／ml?！觥猼f’一一關鍵詞：護‘，幽
4、，莖墊．1鎏，低溫酶p譬己o?一l擴艘青籜堿性日8舫酶耩溯舶襲i＆敷分≯突變AbstractPen耙itliumexpansranPF898is8mutantstrainobtainedbymanygenerationmutagenesistcanproduceanalkalinelipaseatahighlevel。ToresearchonthegeneandproteinstructureofthelipasefromPenicilliumexpansumPF898(designatedPEL)。improveitspropertyofcoId-activity．Wehavedone
5、theresearchasfollows=1．OverexpressionofPELgeneinPichiapastorisThealkalinelipasegeneofPenicilliumexpansum(PEL)WaScolonedintotheyeastintegrativeplasmidpPIC3。5K。whichWaSthentransformedintoHis4mutantyeastGSI15RecombinantPichiastrainswereobtained強minimaloliveoil-methanolplatesscreeningandconfirmedbyPC
6、R．TheexpressionproductsofPELgenewasanalysisbySDS—PAGEandoliveoilplate，andtheresultindicatedthatPELgeneWaSfunctionallyoverexpressedinPichiapastorisandup格鮐％ofthesecretedprotein．Recombinantlipasehad8molecularmassof28kD,showingarangesimilar協(xié)thatofPEkcouldhydrotyzeoliveoilandformedclearhalosintheolive
7、oilplates．Fourdifferentstrategies(differentmedia，pH，glycerolandmethanolconcentration)wereappliedtooptimizethecultivationconditions。TheactivityofIipasewasupto260u／mlafter72hundertheoptimalcultivationconditions．Itispoint
