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《油菜脂肪酶基因克隆及表達(dá)的研究》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、j勞震逢戈.摯博士學(xué)位論文油菜脂肪酶基因的克隆及表達(dá)研究摘要脂肪酶是一個超級基因家族,廣泛存在于動植物和微生物中。脂肪酶主要分為兩類,即GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶。已有的研究表明,GDSL脂肪酶具有脂水解活性,在食品、香料、化妝品等行業(yè)中具有潛(j在的應(yīng)用價值。而且,植物中GDSL脂肪酶可能在調(diào)控植物生長和發(fā)育中扮演重要角色。油菜是十字花科油料作物,與擬南芥具有較近的親緣關(guān)系,已經(jīng)成為研究植物油脂代謝的重要材料,因此研究油菜中GDSL脂肪酶在油脂代謝過程中的作用將有助于揭示其與植物生長發(fā)育的
2、關(guān)系,同時也為油菜脂肪酶的應(yīng)用打下理論基礎(chǔ)。本研究通過對擬南芥GDSL脂肪酶基因及其蛋白編碼序列的生物信‘息學(xué)分析、油菜GDSL脂肪酶基因全長cDNA序列的克隆和表達(dá),以及對BnLIPl基因進(jìn)行原核表達(dá)等研究,得出以下結(jié)果:1)對擬南芥GDSL脂肪酶基因及其編碼的氨基酸序列的生物信息學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的分析?;谏镄畔W(xué)數(shù)據(jù)庫的資源,獲得了99個擬南芥GDSL脂肪酶基因,對應(yīng)107個非冗余cDNA序列。研究結(jié)果顯示,它們的基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,分別含有1~13個內(nèi)含子,而且內(nèi)含子大小從。幾十bp到lkb不
3、等。這些基因在擬南芥染色體(ChromosomesI~V)上呈j澎芡通文學(xué)博士學(xué)位論文無規(guī)律分布,有的GDSL脂肪酶基因在染色體的某些區(qū)域如染色體I的短臂近著絲點區(qū)域、長臂中部及近端粒區(qū)域集中分布,也有的基因在染色體上呈串聯(lián)分布。序列同源性比對發(fā)現(xiàn),編碼不同GDSL脂肪酶蛋白的氨基酸序列具有相對保守的區(qū)域,但是序列之間的同源性并不高。在進(jìn)化關(guān)系上,擬南芥GDSL脂肪酶分為三組(GroupsI—III),分別由28、40和39個成員組成。通過結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),擬南芥中大部分GDSL脂肪酶具有典型的GD
4、SL脂肪酶的特征,即它們的GDSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域,、(PF00657)靠近N.端,前面的氨基酸序列可能作為信號肽介導(dǎo)蛋白的分泌。但是,個別GDSL脂肪酶的GDSL結(jié)構(gòu)域在N一端或位于蛋白序列的中部,而有的氨基酸序列中同時具有多個GDSL脂肪酶的結(jié)構(gòu)域。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析結(jié)果顯示,有99個脂肪酶的N.端含有長度為6-113個氨基酸的信號肽,它們可能負(fù)責(zé)介導(dǎo)蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng),然后分泌到細(xì)胞的其它部位甚至胞外。另有2個GDSL脂肪酶蛋白(Acc.Nos.INP195980,NP173441)很可能分別定位
5、到線粒體和葉綠體,4個蛋白(Acc.Nos.NP_199404,NP_201098,NP_199004,NP_196001)中沒有明確的亞細(xì)胞定位信號。由此可見,擬南芥GDSL脂肪酶的確是一個大家族,各成員在序列、基因結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)域的位置、亞細(xì)胞定位特征等方面都具有不同程度的多樣性。擬南芥的大部分GDSL脂肪酶基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜,序列同源性不高,GDSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域靠近N.端,而且具有分泌信號?;谀壳暗难芯繄蟮?,這些GDSL脂肪酶很可能在擬南芥的種子萌發(fā)。IIj肇芡魚戈學(xué)博士學(xué)位論文,(GroupIII
6、)、花發(fā)育及抗逆反應(yīng)(GroupII)等過程中發(fā)揮重要作用。2)從油菜種子萌發(fā)的黃化幼苗中克隆了BnLIPl全長cDNAfGenBankAcc.No.AY870270),其大小為1318bp,推導(dǎo)該序列編碼一個含389個氨基酸殘基、分子量為43.32kDa的蛋(Acc.No.AAX58135)。BnLIPl基因序列與擬南芥GDSL脂肪酶基因序列具有較高的同源性,其中與Arab.j的同源性達(dá)70%;而在氨基酸水平上BnLIPl蛋白與Arab.1。的同源性達(dá)820/6。通過氨基酸序列的多重比對發(fā)現(xiàn),B
7、nLIPl的氨基酸序列與部分已報道的植物GDSL脂肪酶具有多個保守的區(qū)域,其中含有絲氨酸活性位點的GDSL.motif靠近蛋白的N-端,該motif中玎e.42取代了Leu;同時推測Ser.41、Asp一180(或Asp-345)、His一348三者組成具有催化活性的三聯(lián)體。由此可見,所獲得的cDNA編碼的蛋白具有GDSL脂肪酶的一級結(jié)構(gòu)特征,而且該蛋白具有GDSL脂肪酶結(jié)構(gòu)域,因此推測BnLIPl是GDSL脂肪酶家族的成員。預(yù)測發(fā)現(xiàn),BnLIPl蛋白具有4C個N.糖基化位點,其在進(jìn)化上與擬南芥G
8、roupIII的成員尤其是Arab.1的親緣關(guān)系最近,屬于GroupIII蛋白家族。此外,還克隆了該基因的基因組序列(GenBankAcc.No.AY871275),該序列長度為1601bp,含有4個內(nèi)含子,與擬南芥中的大多數(shù)GDSL脂肪酶基因類似,其基因結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。同時,Southern雜交分析表明其很可能以多拷貝的形式存在于油菜基因組中。。組織器官表達(dá)分析結(jié)果表明,BnLIPl基因在油菜休眠種子以及萌發(fā)III≯矛芡魚名學(xué)博士學(xué)位論文后3天之前的材料中不表達(dá),而從萌發(fā)后第3天開