研究人肝細(xì)胞中總砷及砷代謝產(chǎn)物的分析方法的論文

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1、研究人肝細(xì)胞中總砷及砷代謝產(chǎn)物的分析方法的論文研究人肝細(xì)胞中總砷及砷代謝產(chǎn)物的分析方法的論文【摘要】本工作研究了冷消解、微波消解、高壓密閉消解方法對(duì)超聲破碎后細(xì)胞中砷的icpms測(cè)定的影響，并與直接進(jìn)樣測(cè)定結(jié)果作對(duì)比。結(jié)果表明，微波消解法和高壓密閉消解法效果較好，測(cè)定的精密度以rsd表示，分別為2.1％和1.2％；日間6次測(cè)定的精密度分別為1.２％和２.０％；元素加標(biāo)回收率均在95.7％～108.1％范圍。用４種消解方法對(duì)應(yīng)的icpms方法檢出限介于0.74～0.93μg/l之間，符合痕量分析要求。本工作還建立了高效液相色譜(hplc)與電感耦合等離子體質(zhì)譜(icpms)聯(lián)用技術(shù)對(duì)1

2、μmol/l染砷組細(xì)胞樣品中的砷化學(xué)形態(tài)進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)除了存在無機(jī)砷(as(ⅲ)和as(ⅴ))外，同時(shí)存在二甲基砷(dma)和一種甲基砷中間代謝產(chǎn)物?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)胞消解高效液相色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜肝細(xì)胞砷化學(xué)形態(tài)1引言砷是人體中最豐富12種元素之一，同時(shí)砷也是人類確認(rèn)的致癌毒物[1,2]。長(zhǎng)期接觸砷會(huì)對(duì)人體多種組織、器官造成危害，嚴(yán)重?fù)p害人類健康[3]。近年來，隨著人們對(duì)健康程度的重視，砷在人體內(nèi)代謝過程的研究越來越受到人們的關(guān)注。由于砷的毒性很大，因而不能直接進(jìn)行人體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)。有研究報(bào)告不同物種之間的砷代謝過程存在很大差異，即使與人同屬靈長(zhǎng)類的猩猩，其體內(nèi)對(duì)砷代謝與人類

3、相比也具有非常大的差異[4]，因而動(dòng)物體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)只能對(duì)研究人體內(nèi)砷代謝機(jī)理提供一個(gè)參考數(shù)據(jù)。Www..cOm基于此，目前該領(lǐng)域的研究人員多傾向于通過研究人體細(xì)胞對(duì)外源砷的代謝過程以揭示砷在人體中的代謝機(jī)理。準(zhǔn)確的砷測(cè)定方法在細(xì)胞中砷代謝過程的研究中起到至關(guān)重要的作用。目前細(xì)胞中砷元素的總量測(cè)定方法報(bào)道較少，尤其是樣品前處理方法。研究者通常是通過簡(jiǎn)單的細(xì)胞破碎后直接測(cè)定砷元素含量或者通過冷消解的方式來實(shí)現(xiàn)溶液的均一化[5]。研究發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞破碎的效率較低，并不能得到穩(wěn)定均一的溶液，而采用冷消解時(shí)消解時(shí)間很難把握，而且消解效率不高。本工作將以chang肝細(xì)胞為研究對(duì)象，在細(xì)胞破碎的基礎(chǔ)上對(duì)

4、比了3種不同消解方法對(duì)細(xì)胞中砷總量測(cè)定結(jié)果的影響，從而尋找最佳的細(xì)胞消解方法。此外，在總量測(cè)定的基礎(chǔ)上，本文將探討細(xì)胞中砷化學(xué)形態(tài)的分析方法，以期為砷代謝機(jī)理的研究提供可用的分析方法學(xué)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1儀器與試劑7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(icpms,美國(guó)agilent公司)；1100型高效液相色譜(hplc,美國(guó)agilent公司);hamiltonprpx100(250mm×4.1mm，10μm)陰離子交換色譜柱；speedwavemw3+微波消解系統(tǒng)(德國(guó)berghof公司)；milliq超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)millipore公司)；al104型電子天平(瑞士mett

5、lertoledo公司)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(heraeus公司)。naaso2(分析純,上海試劑二廠)；rpmi1640培養(yǎng)基(美國(guó)gibco公司)；hno3、h2o2為優(yōu)級(jí)純(德國(guó)merck公司)；(nh4)2co3為分析純；超純水(18.2mωcm)由milliq超純水系統(tǒng)制得；agilent多元素混標(biāo)(part#51834687)，agilent內(nèi)標(biāo)(part#51834682)，10μg/lli、y、ce和tl的調(diào)諧液(美國(guó)agilent公司)；asi3、as2o5(美國(guó)alfaaesar公司)；二甲基胂酸(dma,美國(guó)acrosorganics公司)；甲基胂酸(mma)

6、、砷膽堿(asc)、砷甜菜堿(asb)(清華大學(xué))；人張氏肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞(changlivercell)購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞染砷及收集染砷細(xì)胞樣品是與沈陽(yáng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)合作培養(yǎng)獲得。細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、傳代后，按不同濃度劃分，共設(shè)置4組(即4個(gè)六孔版)，每塊六孔板第一個(gè)孔為不染砷對(duì)照樣，其它5個(gè)孔為染砷樣。將密度約為1×105個(gè)/ml的chang肝細(xì)胞接種于六孔板的培養(yǎng)皿中，每孔加入4mlrpmi1640培養(yǎng)基（內(nèi)含10%胎牛血清、100u/ml的青、鏈霉素)。將細(xì)胞繼續(xù)在co2培養(yǎng)箱中放置24h，待細(xì)胞完全貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后，分別加入用培養(yǎng)基配制的終濃度為1、5、10和

7、20μmol/l的naaso2溶液，37℃、5%co2孵育24h。在達(dá)到規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間后，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用pbs反復(fù)沖洗。用細(xì)胞刷刮下六孔板各孔內(nèi)貼壁細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到5.0ml離心管中(每管大約1.0ml樣品，約含2.5×106個(gè)細(xì)胞)，超聲破碎后密封，于－70℃下進(jìn)行保存。2.2.2細(xì)胞樣品前處理(1)直接測(cè)定：將約含2.5×106個(gè)細(xì)胞的超聲破碎后的樣品經(jīng)超聲混勻后用超純水稀釋約10倍，定重，以89y為內(nèi)標(biāo)，直接進(jìn)樣進(jìn)行