脂肪酶酶活測(cè)定方法

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1、脂肪酶是一種特殊的水解酶，廣泛地存在于動(dòng)物組織、植物種子和微生物體中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯產(chǎn)生單或雙甘油酯和游離脂肪酸，將天然油脂水解為脂肪酸及甘油，同時(shí)也能催化酯合成和酯交換的酶。其在輕工、化工、醫(yī)藥、食品等行業(yè)有廣泛的用途。近年來(lái)，隨著非水酶學(xué)和界面酶學(xué)的不斷深入，脂肪酶應(yīng)用也不斷地?cái)U(kuò)展，被廣泛應(yīng)用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中間體的選擇性基團(tuán)保護(hù)、高聚物的合成、肽合成等方面，應(yīng)用前景廣闊。脂肪酶在微生物中有廣泛的分布。脂肪酶催化的反應(yīng)是:甘油三酸酯+水→甘油二酸酯+游離脂肪酸→甘油酸酯+游離脂肪酸→甘油+游離脂肪酸。脂肪

2、酶只能在異相系統(tǒng)，即在油-水界面上作用，對(duì)水溶性底物無(wú)作用，這一點(diǎn)在有機(jī)合成中合成手性中間體方面具有很多的優(yōu)越性。1滴定法（參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，適用于脂肪酶制劑）1.1脂肪酶活力定義為1g固體酶粉（或1mL液體酶），在一定溫度的pH條件下，1min水解底物產(chǎn)生1μmol的可滴定的脂肪酸，即為一個(gè)酶活力單位，以u(píng)/g（u/mL）表示。1.2測(cè)定原理脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油，所釋放的脂肪酸可用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行中和滴定，用pH計(jì)或酚酞指示反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)消耗的減量，計(jì)算其酶活力。反應(yīng)式為：RCOOH+NaOH→

3、RCOONa+H2O。1.3儀器設(shè)備恒溫水浴箱，移液槍?zhuān)咚賱驖{機(jī)，pH計(jì)，電磁攪拌器1.4試劑溶液95％酒精4%聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）：稱(chēng)取4gPVA，加蒸餾水80mL，沸水中加熱，并不斷攪拌，使其完全溶解，慢速攪拌，以免產(chǎn)生過(guò)多氣泡，冷卻后定容至100mL，用雙層紗布過(guò)濾后備用。橄欖油(分析純)底物溶液：按4%聚乙烯醇：橄欖油=3:1比例混合，用高速勻漿機(jī)處理6min（分兩次處理，間隔5min，每次處理3min）。pH7.5磷酸緩沖液：稱(chēng)取十二水磷酸氫二鈉39.62g，磷酸二氫鉀1.96g，用水溶解并定容至500mL，

4、調(diào)節(jié)溶液的pH到7.5±0.05。0.05mol/L氫氧化鈉按GB/T601配制與標(biāo)定。使用時(shí)稀釋10倍。10g/L酚酞指示液：GB/T603配制。1.5待測(cè)酶液的制備稱(chēng)取酶樣品1g~2g，精確至0.0002g，用磷酸緩沖液溶解并稀釋。如果是粉末，可加少量緩沖液研磨再稀釋。測(cè)定時(shí)控制酶液濃度，樣品與對(duì)照消耗堿量之差控制在1mL~2mL范圍內(nèi)。1.6測(cè)定1.6.1電位滴定法①按pH計(jì)使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行儀器校正；②取兩個(gè)100mL燒杯，分別作為空白A和樣品B，分別加入底物溶液4mL和緩沖液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.

5、2℃水浴中預(yù)熱5min，然后各加1mL酶液，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B中立即補(bǔ)加15.00mL95％酒精終止反應(yīng)，取出。③在燒杯中加入一轉(zhuǎn)子，置于電磁攪拌器上，邊攪拌，邊用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至pH10.3，為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。1.6.2指示劑滴定法①取兩個(gè)100mL三角瓶，分別作為空白A和樣品B，分別加入底物溶液4mL和緩沖液5mL，再于A中加入95％酒精15.00mL，于40℃±0.2℃水浴中預(yù)熱5min，然后各加1mL酶液，立即混勻計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，于B中立即補(bǔ)加15.00mL95％酒

6、精終止反應(yīng)，取出。②于A、B瓶中各酚酞兩滴，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至微紅色并保持30s不退色為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。1.6.3計(jì)算脂肪酶制劑的酶活力按以下公式計(jì)算：式中：X1——樣品的酶活力，u/g；V1——滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mL）；V2——滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位為毫升（mL）；c——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液，單位為摩爾每升（mol/L）50——0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00mL相當(dāng)于脂肪酸50μmol；n1——樣品的稀釋倍數(shù)；0.05——?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系

7、數(shù)；15——反應(yīng)時(shí)間15min，以1min計(jì)算。4討論影響脂肪酶測(cè)定結(jié)果有很多因素，其中底物、反應(yīng)溫度和pH因素影響最大。在滴定法中，以前國(guó)外有報(bào)導(dǎo)測(cè)定脂肪酶酶活時(shí)，不將底物制成乳化液，直接在攪拌狀態(tài)下對(duì)油脂進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后用堿滴定生成的脂肪酸。不乳化測(cè)得的結(jié)果平行性較差，這可能是反應(yīng)過(guò)程中的隨機(jī)誤差引起的。因?yàn)椴蝗榛瘯r(shí)，反應(yīng)體系是酶的水溶液加入底物橄欖油中，水與油是互不相溶的，必然造成體系的不均勻，酶不能與底物充分接觸，反應(yīng)不完全，因此測(cè)定的平行性較差，可比性也差。酶都有其最適的反應(yīng)溫度，在不同溫度下酶所表現(xiàn)的活性也不同，溫度的升高可以

8、加快反應(yīng)速度，但會(huì)引起酶蛋白變性失活。同一濃度的堿性脂肪酶在相同的溫度下，對(duì)同樣的底物作用，在不同的pH環(huán)境中，所測(cè)得的酶活也不同。