酶活測(cè)定方法

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1、、酶活測(cè)定方法還原法酶與底物在特定的條件下反應(yīng),酶可以促使底物釋放出還原性的基團(tuán)。在此反應(yīng)體系中添加化學(xué)試劑,酶促反應(yīng)的產(chǎn)物可與該化學(xué)試劑發(fā)生反應(yīng),生成有色物質(zhì)。通過(guò)在特定的波長(zhǎng)下比色,即可求出還原產(chǎn)物的含量,從而計(jì)算出酶活力的大小。色原底物法通過(guò)底物與特定的可溶性生色基團(tuán)物質(zhì)結(jié)合,合成人工底物。該底物與酶發(fā)生反應(yīng)后,生色基團(tuán)可被釋放出來(lái),用分光光度法即可測(cè)定顏色的深淺,在與已知標(biāo)準(zhǔn)酶所做的曲線(xiàn)比較后,即可求出待測(cè)酶的活力。粘度法該法常用于測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情況下可形成極高的粘度,當(dāng)酶作用于粘性底物時(shí)木聚糖和β-葡聚糖會(huì)被切

2、割成較小的分子使其粘度大為降低?；赑oiseuille定律我們知道,只要測(cè)定一定條件下溶劑和樣品溶液的運(yùn)動(dòng)粘度,便可計(jì)算特性粘數(shù),并以此來(lái)判斷酶的活力。高壓液相色譜法酶與其底物在特定的條件下充分反應(yīng)后,在一定的色譜條件下從反應(yīng)體系中提取溶液進(jìn)行色譜分析,認(rèn)真記錄保留時(shí)間和色譜圖,測(cè)量各個(gè)樣的峰高和半峰高,計(jì)算出酶促反應(yīng)生成物的含量,從而換算出酶活力的數(shù)值。免疫學(xué)方法常用于酶活性分析的免疫學(xué)方法包括:免疫電泳法、免疫凝膠擴(kuò)散法。這兩種方法都是根據(jù)酶與其抗體之間可發(fā)生特定的沉淀反應(yīng),通過(guò)待測(cè)酶和標(biāo)準(zhǔn)酶的比較,最終確定酶活力。免疫學(xué)方法檢側(cè)度非常靈敏,可檢側(cè)出經(jīng)過(guò)極度稀釋后樣品中

3、的酶蛋白,但其缺點(diǎn)是不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的酶產(chǎn)品需要有不同特定的抗體發(fā)生反應(yīng)。瓊脂凝膠擴(kuò)散法將酶作用的底物與瓊脂混合熔融后,倒入培養(yǎng)皿中或載波片上制成瓊脂平板。用打孔器在瓊脂平面上打出一個(gè)約4-5mm半徑的小孔。在點(diǎn)加酶樣并培養(yǎng)24h以后,用染色劑顯色或用展開(kāi)劑展開(kāi)顯出水解區(qū),利用水解直徑和酶活力關(guān)系測(cè)定酶活力。蛋白酶活力測(cè)定法本方法適用于釀造醬油時(shí)在制品菌種、成曲的蛋白酶活力測(cè)定。1福林法1.1試劑及溶液:以下試劑都為分析純1.1.1福林試劑(Folin試劑):于2000mL磨口回流裝置內(nèi),加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g,鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸餾

4、水700mL,85%磷酸50mL,濃鹽酸100mL,文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸鋰(Li2SO4)50g,蒸餾水50mL,混勻,加入幾滴液體溴,再煮沸15min,以驅(qū)逐殘溴及除去顏色,溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色,需要再加幾滴溴液,再煮沸除去之。冷卻后,定容至1000mL,用細(xì)菌漏斗(No4～5)過(guò)濾,置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。1.1.20.4mol碳酸鈉溶液:稱(chēng)取無(wú)水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。1.1.30.4mol三氯乙酸(TCA)溶液:稱(chēng)取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至

5、1000mL。1.1.4pH7.2磷酸鹽緩沖液:稱(chēng)取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。稱(chēng)取磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。取A液28mL和B液72mL,再用蒸餾水稀釋1倍,即成0.1molpH7.2的磷酸鹽緩沖液。1.1.52%酪蛋白溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取干酪素2g,稱(chēng)準(zhǔn)至0.002g,加入0.1N氫氧化鈉10mL,在水浴中加熱使溶解(必要時(shí)用小火加熱煮沸),然后用pH7.2磷酸鹽緩沖液定容至100mL即成。配制后應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存,否則極

6、易繁殖細(xì)菌,引起變質(zhì)。1.1.6100μg/mL酪氨酸溶液:精確稱(chēng)取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐步加入6mL1N鹽酸使溶解,用0.2N鹽酸定容至100mL,其濃度為1000μg/mL,再吸取此液10mL,以0.2N鹽酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。此溶液配成后也應(yīng)及時(shí)使用或放入冰箱內(nèi)保存,以免繁殖細(xì)菌而變質(zhì)。1.2儀器a.分析天平:感量0.1mg;b.581-G型光電比色計(jì)或72型分光光度計(jì);c.水浴鍋;d.1、2、5、10mL移液管等。1.3操作1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制1.3.1.1按下表配制各種不同濃度的酪氨酸溶液(表1)。表

7、1配制各種不同濃度的酪氨酸溶液━━━━━━━━━━━┳━━━━━━━━━━━━━━━━━━┃管號(hào)試劑┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━┃1┃2┃3┃4┃5┃6━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━蒸餾水,mL┃10┃8┃6┃4┃2┃0100μg/mL酪氨酸,mL┃0┃2┃4┃6┃8┃10酪氨酸最終濃度,μg/ml┃0┃20┃40┃60┃80┃100━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━1.3.1.2測(cè)定步驟:取6支試管編號(hào)按表1分別吸取不同濃度酪氨酸1mL