人胰島素自身抗體iaa酶聯(lián)免疫分析elisa

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1、人胰島素自身抗體（IAA）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關液體樣本中胰島素自身抗體（IAA）含量。實驗原理：本試劑盒應用雙抗原夾心法測定標本中人胰島素自身抗體（IAA）水平。用純化的人胰島素自身抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被的微孔中依次加入胰島素自身抗體，再與HRP標記的胰島素自身抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標抗原復合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的胰島素自身抗體

2、（IAA）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人胰島素自身抗體（IAA）濃度。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1個1個酶標包被板1×481×962-8℃保存標準品：180pmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存標準品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存酶標試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑

3、B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存樣本處理及要求：1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。2.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘

4、左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。95.組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮

5、迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。操作步驟1.標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別

6、加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為120pmol/L，80pmol/L，40pmol/L，20pmol/L，10pmol/L）。2.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔

7、。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B

8、50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。注意事項：1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-3