牛布魯氏菌抗體酶聯(lián)免疫分析elisa

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牛布魯氏菌抗體酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于檢測牛血清，血漿中布魯氏菌抗體水平。實驗原理：本試劑盒采用雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中牛布魯氏菌抗體。用純化的牛布魯氏菌抗原包被微孔板，制成固相抗原，可與樣品中布魯氏菌抗體相結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標記的布魯氏菌抗原結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標抗原復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中牛布魯氏菌抗體的存在與否。試劑盒組成：試劑盒組成48孔配置96孔配置保存說明書1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1個1個酶標包被板1×481×962-8℃保存陰性對照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存陽性對照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶標試劑3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存樣品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存顯色劑B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存樣本處理及要求：1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2.血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。5.8 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。6.標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.7.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟：1.編號：將樣品對應(yīng)微孔按序編號，每板應(yīng)設(shè)陰性對照2孔、陽性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）2.加樣：分別在陰、陽性對照孔中加入陰性對照、陽性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。4.配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。7.溫育：操作同3。8.洗滌：操作同5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。結(jié)果判定：試驗有效性：陽性對照孔平均值≥1.00;陰性對照平均值≤0.10臨界值（CUTOFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15陰性判定：樣品OD值<臨界值（CUTOFF）者為布魯氏菌抗體陰性陽性判定：樣品OD值≥臨界值（CUTOFF）者為布魯氏菌抗體陽性注意事項1．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。3．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。4．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。5．底物請避光保存。6．試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，參考波長為630nm7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時必須注意安全。保存條件及有效期1．試劑盒保存：；2-8℃。8 2．有效期：6個月FORRESEARCHUSEONLY8 BovineBrucellaantibodyDrugNamesGenericName：BovineBrucellaantibody(BrucellaAb)ELISAKit.PurposeThiskitallowsforthedeterminationofBrucellaAbconcentrationsinBovineserum,andotherbiologicalfluids.PrincipleoftheassayThekitassayBrucellaAblevelinthesample，usePurifiedBrucellaantigentocoatmicrotiterplatewells,makesolid-phaseantigen,thenaddBrucellaAbtowells,CombinedWithBrucellaAb,afterwashingandremovingnon-combinativeantibodyandothercomponents,thenCombinedBrucellaantigenwhichwithHRPlabeledbecomeantigen-antibody-enzyme-antigencomplex,afterwashingCompletely,AddTMBsubstratesolution,,TMBsubstratebecomesbluecolorAtHRPenzyme-catalyzed,reactionisterminatedbytheadditionofasulphuricacidsolutionandthecolorchangeismeasuredspectrophotometricallyatawavelengthof450nm.ComparedwiththeCUTOFFvalue,accordingtothistojudgeBrucellaAbexistinthesampleornot.8 MaterialsprovidedwiththekitMaterialsprovidedwiththekit48determinations96determinationsStorageUsermanual11Closureplatemembrane22Sealedbags11Microelisastripplate112-8℃Negativecontrol0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃Positivecontrol0.5ml×1bottle0.5ml×1bottle2-8℃HRP-Conjugatereagent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃Samplediluent3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionA3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃ChromogenSolutionB3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃StopSolution3ml×1bottle6ml×1bottle2-8℃washsolution（20ml×20fold）×1bottle（20ml×30fold）×1bottle2-8℃Specimenrequirements1.serum-coagulationatroomtemperature10-20mins，centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.2.plasma-usesuitedEDTAorcitrateplasmaasananticoagulant,mix10-20mins,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.3.Urine-collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.TheOperationofHydrothoraxandcerebrospinalfluidReferencetoit.4.cellculturesupernatant-detectsecretorycomponents,collectsueasterilecontainer,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,detectthecompositionofcells,Dilutcellsuspension8 withPBS（PH7.2-7.4）,Cellconcentrationreached1million/ml,repeatedfreeze-thawcycles,damagecellsandreleaseofintracellularcomponents,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant,Ifprecipitationappeared,Centrifugalagain.1.Tissuesamples-Aftercuttingsamples,checktheweight,addPBS（PH7.2-7.4）,Rapidlyfrozenwithliquidnitrogen,maintainsamplesat2-8℃aftermelting,addPBS（PH7.4）,HomogenizedbyhandorGrinders,centrifugation20-minatthespeedof2000-3000r.p.m.removesupernatant.2.extractassoonaspossibleafterSpecimencollection,andaccordingtotherelevantliterature,andshouldbeexperimentassoonaspossibleaftertheextraction.Ifitcan’t,specimencanbekeptin-20℃topreserve,Avoidrepeatedfreeze-thawcycles.3.Can’tdetectthesamplewhichcontainNaN3,becauseNaN3inhibitsHRPactive.Assayprocedure1.Number:tosamplecorrespondmicrotitrationwellandNumberSequence,eachplateshouldbesetfemininecomparison2wells,masculinecomparison2wells,blankcomparison1well(don’taddsampleandHRP-Conjugatereagenttoblankcomparisonwell,othereachsteptheoperationaresame).2.addsample：separatelyaddPositivecontrolandNegativecontrol50μltothePositiveandNegativewell.addSampledilution40μltotestingsamplewell,thenaddtestingsample10μl.addsampletothebottomofELISAplatescoatedwell,don’ttouchthewellwallasfaraspossible,andGentlymix.3.Incubate:AfterclosingplatewithClosureplatemembrane,incubatefor30minat37℃.4.Configurateliquid:30-fold(or20-fold)washsolutiondiluted30-fold(or20-fold)withdistilledwateruntil600ml,andreserve.5.washing：UncoverClosureplatemembrane,discardLiquid,drybyswing,8 addwashingbuffertoeverywell,stillfor30sthendrain,repeat5times,drybypat.6.addenzyme：AddHRP-Conjugatereagent50μltoeachwell,excepttheblankwell.7.incubate：Operationwith3.8.washing：Operationwith5.9.color：AddChromogenSolutionA50ulandChromogenSolutionBtoeachwell,evadethelightpreservationfor15minat37℃10.Stopthereaction：AddStopSolution50μltoeachwell,Stopthereaction(thebluecolorchangetoyellowcolor).11.assay：takeblankwellaszero,Readabsorbanceat450nmafterAddingStopSolutionandwithin15min.DeterminetheresultTestvalidity:theaverageofPositivecontrolwell≥1.00;theaverageofNegativecontrolwell≤0.10.CalculateCritical(CUTOFF):Critical=theaverageofNegativecontrolwell+0.15.Negativecontrol:sampleOD