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1、臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第四章標(biāo)記物及其與抗原抗體的結(jié)合物制備汪付兵/R·20107目錄第一節(jié)標(biāo)記物種類及特性第二節(jié)常見交聯(lián)劑的種類及特性第三節(jié)放射性核素與抗原抗體結(jié)合物制備第四節(jié)熒光素與抗原抗體結(jié)合物制備第五節(jié)酶與抗原抗體結(jié)合物制備第六節(jié)化學(xué)發(fā)光劑與抗原抗體的結(jié)合物制備第七節(jié)稀土離子與抗原抗體的結(jié)合物制備第八節(jié)量子點(diǎn)與抗原抗體的結(jié)合物制備第九節(jié)膠體金與抗原抗體的結(jié)合物制備第一節(jié)標(biāo)記物的種類及特性重點(diǎn)提示放射性核素?zé)晒馕镔|(zhì)酶和酶作用底物化學(xué)發(fā)光劑量子點(diǎn)膠體金第一節(jié)標(biāo)記物的種類及特性標(biāo)記免疫技術(shù)=免疫技術(shù)+標(biāo)記技
2、術(shù)抗原抗體反應(yīng)示蹤標(biāo)記物高特異性高靈敏性精密儀器檢測(cè)高精密性既可以與抗原或抗體相結(jié)合，又可以被相應(yīng)的儀器所檢測(cè)的物質(zhì)，這就是標(biāo)記物標(biāo)記物在免疫分析中的作用在于示蹤標(biāo)記并能夠被檢測(cè)放射性核素125I特點(diǎn)化學(xué)性質(zhì)較活潑，標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，容易獲取高比活性的標(biāo)記結(jié)合物；衰變過程不產(chǎn)生電離輻射強(qiáng)的β射線，對(duì)標(biāo)記多肽，蛋白抗原分子的免疫活性影響?。凰プ冞^程中釋放γ射線，可用γ計(jì)數(shù)器測(cè)量，方法簡(jiǎn)便，易推廣應(yīng)用；半衰期(60天)適中、核素豐度(>95％)及計(jì)數(shù)率相對(duì)較高。二、熒光物質(zhì)有機(jī)化合物熒光素稀土離子螯合物熒光底物（
3、酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)）熒光素異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC）四乙基羅丹明（rhodamine,RB200）四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC）藻紅蛋白(phycoerthrin,PE)常用的熒光素特性熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測(cè)定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm
4、（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)稀土離子鑭系元素屬于三價(jià)稀土離子，包括銪（Eu3+）、釤（Sm3+）、鋱(Tb3+)、釹（Nd3+）、鏑（Dy3+）和鈰(Ce3+)等。銪是標(biāo)記抗原抗體應(yīng)用最廣的元素。游離的稀土離子熒光比較弱，但與適當(dāng)?shù)尿蟿┤绂?萘甲酰三氟丙酮（β-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使熒
5、光得到增強(qiáng)。稀土離子的熒光特性如下：具有較大的Stokes位移，發(fā)射光譜和激發(fā)光譜不會(huì)相互重疊。熒光壽命長(zhǎng)，熒光半衰期介于10-1000μs之間。激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光譜帶很窄，甚至不到10nm。其他熒光物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，但經(jīng)酶催化后便具有強(qiáng)熒光。如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷，受β-半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲基傘酮，可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性磷酸酶的底物（4-甲基傘酮磷酸鹽）和辣根過氧化物酶的底物（對(duì)羥基苯乙酸）等，都具有熒光底物的性質(zhì)。三、
6、酶和酶作用底物常用的酶標(biāo)記物有辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)每種酶可與相應(yīng)的顯色或發(fā)光底物作用，產(chǎn)生典型的有色反應(yīng)物或化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，通過反應(yīng)的顏色或發(fā)光強(qiáng)度對(duì)被檢物進(jìn)行定性、定量分析。辣根過氧化物酶HRP辣根過氧化物酶（HRP）糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基） 與275nm（主酶）OD值
7、之比RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶堿性磷酸酶ALP及β-半乳糖苷酶堿性磷酸酶（AP）菌源性AP腸粘膜APβ–半乳糖苷酶（β-Gal）用于均相酶免疫測(cè)定HRP底物HRP的底物DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種H2O2為受氫體，HRP對(duì)受氫體的專一性很高HRP的常見底物鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，
8、加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測(cè)定波長(zhǎng)492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測(cè)定波長(zhǎng)450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。HRP的常見底物對(duì)羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylaceticacid，HPA）HPA具有熒光底物性質(zhì)，在H2O2存在下被HRP氧化成二聚體（熒光物質(zhì)），在350nm激發(fā)光作用下，發(fā)出450nm波長(zhǎng)的熒光。H2O2HRP+熒光氧化二聚體ALP底物常用
