任務(wù)單元抗原抗體的制備課件.ppt

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1、任務(wù)六抗原抗體的制備主要內(nèi)容單元一抗原的制備單元二抗血清的制備單元三單克隆抗體的制備單元四基因工程抗體學(xué)習(xí)目標(biāo)1.掌握抗血清的制備過程及鑒定方法，正確判定抗血清的質(zhì)量，能正確處理抗血清制備中的干擾因素。2.掌握單克隆抗體技術(shù)的原理、制備流程和應(yīng)用。3.正確理解多克隆抗體、單克隆抗體和佐劑的概念。4.知曉免疫原的制備方法及意義。5.了解基因工程抗體的優(yōu)點(diǎn)、種類和應(yīng)用。單元一抗原的制備抗原（免疫原）：免疫原（immunogen)指用于制備抗體的抗原(antigen)或半抗原(hapten）?？乖w粒性抗原可溶性抗

2、原蛋白質(zhì)抗原多糖抗原核酸抗原一、顆粒性抗原的制備顆粒性抗原細(xì)胞性抗原：血細(xì)胞和組織細(xì)胞病原體：細(xì)菌、病毒、支原體、寄生蟲等采集靜脈血玻璃珠脫纖維離心、洗滌調(diào)合適濃度（一）綿羊紅細(xì)胞的制備(二)細(xì)菌抗原的制備用途:(1)作為診斷菌液。(2)用于制備免疫血清或診斷血清。1.制備方法培養(yǎng)細(xì)菌分離、鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)合適濃度滅活處理離心、洗滌2.細(xì)菌抗原的檢定1.一般性狀檢定菌種典型；抗原為乳白色懸液；鹽水中不自凝。2.無菌試驗(yàn)甲醛處理后37℃培養(yǎng)2-3d無菌生長(zhǎng)3.純度檢查革蘭氏染色鏡檢10個(gè)視野無雜菌。4.特異性試驗(yàn)玻

3、片凝集試驗(yàn)強(qiáng)陽性。5.定量凝集試驗(yàn)?zāi)r(jià)不低于原血清凝集效價(jià)的50%6.濃度測(cè)定。二、可溶性抗原的制備組織細(xì)胞粗抗原制備----組織、細(xì)胞清洗和去污處理細(xì)胞裂解（搗碎方法）勻漿物提?。ǔ鹾Y物）可溶性抗原制備----勻漿物中目的抗原提取純化（不同純化方法，多次純化）鑒定（定性、定量、特異性、理化性等）分裝、保存可溶性抗原制備的一般流程二、可溶性抗原的制備（一）材料的選取與預(yù)處理（二）細(xì)胞裂解（三）純化抗原的提取（四）抗原的鑒定（五）抗原的濃縮與保存五步驟（一）材料的選取與預(yù)處理組織：新鮮或低溫保存（-40℃）

4、處理方法：（1）器官或組織剪去包膜、結(jié)締組織及大血管，生理鹽水或緩沖液洗去殘留血液和污物，剪成小塊，再搗碎。（2）細(xì)胞緩沖液混懸后離心，再進(jìn)行裂解或搗碎。二、細(xì)胞裂解1.細(xì)胞勻漿（1）高速組織勻漿器法（2）研磨法：玻璃勻漿器2.超聲波破碎法適用范圍：組織細(xì)胞和微生物細(xì)胞。機(jī)制：可能與強(qiáng)聲波作用于溶液時(shí)，氣泡產(chǎn)生、長(zhǎng)大和破碎的空化現(xiàn)象有關(guān)，空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪刀力使細(xì)胞裂解。超聲破碎的效率取決于聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度和細(xì)胞的類型。特別注意：使用時(shí)注意降溫、防止過熱，避免產(chǎn)生氣泡。3.酶處理法適用范圍

5、：多種微生物細(xì)胞機(jī)制：利用酶反應(yīng)，破會(huì)細(xì)胞壁上特殊的鍵，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁的目的。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，酶解條件溫和。缺點(diǎn)：費(fèi)用較高。應(yīng)用做多的是：溶菌酶（專一分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的α-1，4-糖苷鍵）。4.反復(fù)凍融法適用范圍：培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞壁較脆弱的菌體機(jī)制：突然冷凍時(shí)細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便缺點(diǎn)：①破碎率低②引起對(duì)凍融敏感的蛋白質(zhì)變性5.表面活性劑處理法適用范圍：細(xì)菌和培養(yǎng)細(xì)胞機(jī)制：適當(dāng)條件下（溫度、pH、低離子強(qiáng)度），表面離子活性劑與脂蛋白形成微泡，使

6、細(xì)胞膜通透性改變。優(yōu)點(diǎn)：作用溫和最常用的是：SDS，Tween（三）可溶性抗原純化1.蛋白質(zhì)抗原的純化純化方法：（1）超速離心法分離亞細(xì)胞成分和大分子蛋白質(zhì)（2）選擇性沉淀法鹽析法最為經(jīng)典（3）凝膠過濾法（4）離子交換層析法（5）親和層析法（1）超速離心法原理:利用各顆粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉降速度的顆粒,處于不同密度的梯度層內(nèi)，達(dá)到彼此分離的目的。特點(diǎn)：用超速離心或梯度密度離心法純化抗原，極難將某一抗原成分分離出來。應(yīng)用：用于少部分大分子抗原和一些比較輕的抗原物質(zhì)的分離，如IgM、C1q、甲狀

7、腺球蛋白、載脂蛋白A、B等。（2）選擇性沉淀法原理：根據(jù)各蛋白質(zhì)理化特性的差異，采用各種沉淀劑或改變某些條件促使蛋白質(zhì)抗原成分沉淀，從而達(dá)到純化的目的。常用方法：鹽析沉淀法（不同鹽濃度則溶解度不同）；常用33～50％飽和度的硫酸銨。特點(diǎn)：簡(jiǎn)單方便，純度不高，粗提球蛋白。應(yīng)用：在大量制備中先用此法粗提，再純化。（3）凝膠過濾法原理：凝膠具有三維空間多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，經(jīng)適當(dāng)溶液平衡后，裝入層析柱。當(dāng)含有各種分子大小不一的混合物加在凝膠床面時(shí)，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙中很快地通

8、過凝膠床，短時(shí)間內(nèi)被洗脫出來；而分子較小的物質(zhì)則進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)內(nèi)，反復(fù)受到阻滯，洗脫較慢。分成大、中、小三種類型。（4）離子交換層析法原理：利用帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原。各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，所帶電荷不同，與纖維素結(jié)合的能力有差別。當(dāng)梯度洗脫時(shí)，逐步增加流動(dòng)相的離子強(qiáng)度，使加入的離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)纖維素上的電荷位置，從而使血清中的蛋白質(zhì)分成γ球蛋白、α球蛋白、β球蛋