右歸丸對骨髓抑制小鼠造血功能的影響.doc

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1、右歸丸對骨髓抑制小鼠造血功能的影響作者：鄭軼峰張力華秦劍石婭萍周毅【摘要】目的：觀察右歸丸對骨髓抑制小鼠外周血、造血干細胞增殖能力、骨髓細胞周期和凋亡的影響，并探討其可能作用機制。方法：小鼠48只，隨機分為正常組、模型組，右歸丸低、中、高劑量組和陽性對照組，每組8只。除正常組外，余五組均予造模，連續(xù)3天給予腹腔注射環(huán)磷酰胺制備骨髓抑制模型。造模后各組應用相應藥物治療7天。用全自動血細胞分析儀、白細胞計數(shù)法、造血祖細胞培養(yǎng)和流式細胞術(FCM)分別檢測右歸丸對骨髓抑制小鼠外周血、骨髓有核細胞數(shù)、體

2、外培養(yǎng)各系造血祖細胞的集落數(shù)以及骨髓細胞周期和凋亡的影響。結果：右歸丸中、高劑量均能明顯升高外周血紅細胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)、骨髓有核細胞(BMC)數(shù)，高劑量對血小板(PLT)和白細胞(WBC)有明顯升高作用。右歸丸能明顯提高體外培養(yǎng)各系造血祖細胞的集落數(shù)，以中、高劑量效果顯著。右歸丸低、高劑量均能促進骨髓G0/G1期細胞向S期細胞以及S期細胞向G2/M期細胞的轉化，提高G2/M期細胞比例，增殖指數(shù)(PI)明顯升高。右歸丸中、低劑量組的骨髓細胞凋亡比例顯著下降。結論：右歸丸可能通過促進G

3、0期造血干細胞進入細胞周期，進行增殖；加速骨髓細胞修復受損的DNA，通過G1/S和S期監(jiān)測點；抑制造血細胞的凋亡；調(diào)節(jié)造血細胞增殖與凋亡之間的平衡等機制，從而促進損傷骨髓造血功能恢復?！娟P鍵詞】小鼠骨髓抑制右歸丸細胞周期凋亡細胞培養(yǎng)右歸丸出自明代張景岳的《景岳全書》，由熟地、制附子、肉桂、山藥、山茱萸、菟絲子、枸杞、鹿角膠、杜仲、當歸等藥組成，為溫補腎陽的代表方劑，具溫補腎陽、填精益髓之功效。本研究采用60Co伽馬射線和環(huán)磷酰胺(CTX)聯(lián)合制作骨髓抑制小鼠模型，觀察右歸丸對骨髓抑制小鼠外周血細

4、胞、骨髓有核細胞數(shù)、造血干細胞增殖能力、骨髓細胞周期及細胞凋亡的影響，為其在臨床上的進一步應用提供理論依據(jù)。1材料和方法1．1材料8～12周齡BALB／c純系雄性小鼠48只，體質量18～22g(四川大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：川實動管字09號)；右歸丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號：8013042)，使用前用生理鹽水配制成相應濃度的溶液；環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：20080106)；重組人粒細胞集落刺激因子注射液(特爾津，廈門特寶生物工程股份有限公司，批號：2

5、00807820)；碘化丙啶(PI)熒光染液(美國Sigma公司)；60Coγ射線放射源(四川省腫瘤醫(yī)院放療科提供)；全自動血細胞分析儀BC3000Plus型(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；流式細胞儀(EPICSXL型，BeckmanCoulter公司)。1.2方法51．2．1骨髓抑制動物模型的制備參照嚴蘇純[1]等介紹的方法造模。小鼠經(jīng)2.0Gy的60Co照射后第4天開始，每天腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)50mg/kg(于臨用前配制)，連續(xù)給藥3天完成模型制備。1.2.2動物分組與給藥

6、將小鼠隨機分為正常組，模型組，右歸丸低、中、高劑量組和陽性對照組，每組8只。除正常組外，其余五組均進行造模。小鼠造模完成的第2天開始給藥，正常組和模型組每只灌胃0．2ml/（10g·d）的生理鹽水；右歸丸低、中和高劑量組分別給右歸丸濃度為2.25g/kg、4.5g/kg和9.0g/kg，每只小鼠灌胃0.2ml／(10g·d)；陽性對照組每天腹腔注射重組人粒細胞集落刺激因子(GCSF)150μg/kg，共給藥7天。1.2.3外周血細胞計數(shù)最后一次給藥后24小時，經(jīng)小鼠眼球后靜脈叢采血0．1ml，

7、用BC3000Plus型全自動血細胞分析儀進行血常規(guī)檢測。1.2.4骨髓有核細胞懸液的制備最后一次給藥后24小時，以頸椎脫臼法處死各組小鼠，取出股骨，剔除肌肉和結締組織，剪開股骨兩端，用6號針頭以生理鹽水液沖出骨髓細胞，再用4號針頭過濾制成單個骨髓細胞懸液。取部分骨髓細胞懸液在顯微鏡下按白細胞計數(shù)法進行骨髓有核細胞計數(shù)。1.2.5造血祖細胞培養(yǎng)在最后一次給藥后24小時，頸椎脫臼處死各組小鼠，75％酒精浸泡消毒，無菌條件下取出股骨，參考文獻方法[2,3]，按本實驗室常規(guī)培養(yǎng)方法做粒系(CFUG

8、M)、紅系(CFUE、BFUE)和巨核系(CFUMeg)三系造血祖細胞集落培養(yǎng)，每組培養(yǎng)6孔。培養(yǎng)第3天于倒置相差顯微鏡下計數(shù)CFUE細胞集落數(shù)，培養(yǎng)第7天分別計數(shù)BFUE、CFUGM和CFUMeg細胞集落數(shù)。1.2.6細胞周期樣品制備將上述單個骨髓細胞懸液離心（1000r/min，5min)，棄上清，NPBS洗滌2次，去上清液，滴入70％冷乙醇固定細胞，立即混勻，用封口膜封口，放置4℃冰箱冷藏備用。1.2.7細胞周期分析和凋亡細胞測定取上述70％冷乙醇固定的細胞樣品，用PBS洗2