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1、新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗體的制備作者：史群芳楊世蕊，雷陳，孟祥勛，黃超群，王明華【摘要】目的：PCR擴(kuò)增得到新基因ZNFD（Znfdomaincontainingprotein），構(gòu)建pET32a-ZNFD原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)及制備多克隆抗體。方法：通過(guò)PCR的方法克隆新基因ZNFD，選取部分抗原免疫原性較高的部分ORF序列，克隆到原核表達(dá)載體pET32a上，利用大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ZNFD融合蛋白。純化目的蛋白免疫家兔，制備多克隆抗體。通過(guò)瓊脂糖雙向擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)和Westernblot鑒定其效價(jià)和特異性。結(jié)果:經(jīng)測(cè)序鑒定已成功克隆ZNFD基
2、因。通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a-ZNFD，在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，得到相對(duì)分子質(zhì)量約為45kD的融合蛋白。純化蛋白免疫家兔，制備的多克隆抗體具有較強(qiáng)的免疫特異性。結(jié)論：得到純化的ZNFD蛋白，制備的多克隆抗體達(dá)到了一定的效價(jià)，且具有高特異性，為進(jìn)一步研究ZNFD的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】ZNFD基因；鋅指；原核表達(dá)；免疫抗原；多克隆抗體；聚合酶鏈反應(yīng)[Abstract]Objective：TocloneZNFDgenebyPCR,constructexpressionvectorZNFD-pET32a,prepareandobta
3、initspolyclonalantibody.Methods：TheORFfragmentofZNFDwasamplifiedbyPCRandsequenced.PartofORFwasclonedintopET32aprokaryoticexpressingvectortoformpET32a-ZNFDplasmid.His-ZNFDwasexpressedinE.coliRosetta-gami(DE3)inducedbyIPTGandpurifiedbyusingaffinitychromatography.PurifiedHis-ZNFDwasusedtoimmunizera
4、bbitstopreparepolyclonalantibody.RabbitserumspecificityanditstiterweredetectedbydoublediffusionandWesternblot.Results：TheZNFDgenewasclonedandsequenced,andthenpET32a-ZNFDwasconstructedsuccessfully.His-ZNFDprotein,45kDmolecularweight,canbeexpressedinE.coliRosetta-gami(DE3)withhighefficiency.Itscor
5、respondingantibodywasobtainedbyimmunizingrabbitwiththepurifiedprotein.ThedataofdoublediffusionandWesternblotdemonstratedthatthepurifiedantigenhadhighantigenicity.Conclusions：ZNFDgenewasclonedandthepurifiedfusionproteinZNFDwasobtained,ithadhighantigenicity.Polyclonalantibodywasprepared,whichprovi
6、dedreliabletoolsforthefutureresearch.[Keywords]ZNFDgene;Zincfinger;Prokaryoticexpression;Antigenicity;Polyclonalantibody;Polymerasechainreaction6鋅指（zincfingermotif）是存在于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子中的重要結(jié)構(gòu)域之一。1988年P(guān)abo等對(duì)鋅指下了一個(gè)定義：在調(diào)節(jié)蛋白一小段氨基酸序列中，含有幾個(gè)Cys殘基，這些區(qū)域?yàn)橐蕾囦\的DNA結(jié)合域，它通過(guò)結(jié)合Zn2+自我折疊形成短的穩(wěn)定的“手指”樣結(jié)構(gòu)[1]。鋅指類(lèi)蛋白廣泛存在動(dòng)植物和微生物中，
7、它可選擇性的結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)以適應(yīng)生物體發(fā)育、分化和成熟等生命過(guò)程[2]。從酵母到人體，其中人類(lèi)基因組中可能有將近1%的序列編碼含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[3]。1995年Klug等指出鋅指蛋白基因這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子與其他轉(zhuǎn)錄因子一樣，具有重要的基因調(diào)控作用。鋅指蛋白與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化以及人類(lèi)許多疾病相關(guān)[4~6]。本實(shí)驗(yàn)室使用電子克隆的方法獲得了一個(gè)人類(lèi)新基因,基因號(hào)為AY692447，將其同GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)相比較獲得了該基因的可
