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《高產(chǎn)番茄紅素釀酒酵母的設(shè)計(jì)構(gòu)建與發(fā)酵過程優(yōu)化》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中國(guó)第－臓代大學(xué)ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博士學(xué)位論文＿Ｊ，＿１細(xì)綱＿級(jí)學(xué)科化學(xué)工程與技術(shù)：生物化工學(xué)科專業(yè)：作者姓名：陳艷指導(dǎo)教師：元英進(jìn)教授天津大學(xué)研究生院２０１７年５月高產(chǎn)番茄紅素釀酒酵母的設(shè)計(jì)構(gòu)建與發(fā)酵過程優(yōu)化Designandconstructionoflycopene-overproducingSaccharomycescerevisiaeandfermentationprocessoptimization一級(jí)學(xué)科：化學(xué)
2、工程與技術(shù)學(xué)科專業(yè)：生物化工作者姓名：陳艷指導(dǎo)教師：元英進(jìn)教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一七年五月中文摘要異源代謝路徑和底盤細(xì)胞的適配性是異源微生物合成的關(guān)鍵因素。本研究以構(gòu)建高產(chǎn)番茄紅素的釀酒酵母為目標(biāo)，對(duì)底盤細(xì)胞和異源路徑進(jìn)行理性設(shè)計(jì)和交互優(yōu)化，極大地提高番茄紅素產(chǎn)量和純度。與此同時(shí)，針對(duì)改造過程中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵遺傳靶點(diǎn)YPL062W對(duì)萜類物質(zhì)生產(chǎn)的影響進(jìn)行了系統(tǒng)表征，重新注釋了它的生物學(xué)功能。首先，以釀酒酵母CEN.PK2為宿主細(xì)胞構(gòu)建誘導(dǎo)型番茄紅素異源合成路徑。通過兩種增強(qiáng)型GAL誘導(dǎo)策略（Δgal1Δgal7Δgal1
3、0、Δgal80）比較，發(fā)現(xiàn)前者更有利于番茄紅素合成。在此基礎(chǔ)上，敲除ypl062w使得番茄紅素產(chǎn)量提高1.5倍，同時(shí)乙酸積累大量減少，甲羥戊酸（MVA）途徑關(guān)鍵前體乙酰輔酶A的含量增加約1倍，因此敲除ypl062w的釀酒酵母作為后續(xù)研究的底盤細(xì)胞。此外，我們發(fā)現(xiàn)敲除ypl062w能夠有效提升釀酒酵母合成單萜、倍半萜、二萜、三萜及四萜的產(chǎn)量，具有普遍性。通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)敲除ypl062w主要從上調(diào)乙酰輔酶A合成、MVA路徑、異源基因表達(dá)、能量合成、細(xì)胞膜關(guān)鍵組分合成這五個(gè)方面強(qiáng)化異源萜類合成。而且，YPL062W并不
4、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，而是屬于ALD6的核心啟動(dòng)子，且ALD6表達(dá)量與萜類化合物產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此，YPL062W主要通過調(diào)控ALD6轉(zhuǎn)錄作用于萜類合成。在強(qiáng)化前體物質(zhì)供給的底盤細(xì)胞基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化番茄紅素合成路徑，即通過5種CrtE、2種CrtB和3種CrtI的來源組合篩選強(qiáng)化異源路徑通量，獲得產(chǎn)量最優(yōu)的路徑基因組合；并利用啟動(dòng)子強(qiáng)度和整合拷貝數(shù)微調(diào)途徑限速酶BlakesleatrisporaCrtI，提高番茄紅素占總類胡蘿卜素的比重。最后，再優(yōu)化底盤細(xì)胞，即通過考察不同交配型的酵母底盤細(xì)胞以及遠(yuǎn)端遺傳基因座對(duì)番茄紅素合成
5、的影響，進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)量；通過上調(diào)脅迫響應(yīng)因子INO2增強(qiáng)酵母對(duì)番茄紅素的耐受能力；通過引入異源血紅蛋白基因VHb提高細(xì)胞和產(chǎn)物得率。經(jīng)過上述適配優(yōu)化，番茄紅素產(chǎn)量提高近30倍（從2.43mg/gDCW到66.14mg/gDCW），且其占總類胡蘿卜素的比例達(dá)到91.41%。最終經(jīng)發(fā)酵過程（培養(yǎng)基、補(bǔ)料方式、溶氧控制）優(yōu)化，在50L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批試驗(yàn)中，番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到2.75g/L，是目前釀酒酵母中的最高產(chǎn)量。關(guān)鍵詞：番茄紅素，釀酒酵母，底盤細(xì)胞改造，異源路徑優(yōu)化，適配性，YPL062WIABSTRACTThecompa
6、tibilitybetweenheterologousmetabolicpathwayandhostcelliscriticaltoheterologousmicrobialproduction.Here,withtheaimoflycopeneoverproductioninSaccharomycescerevisiae,bothhostcellandheterologouspathwayweredelicatelydesignedandcombinatoriallyoptimized,andconsequently
7、lycopeneoutputandpurityweredrasticallyimproved.Inthemeanwhile,theeffectofYPL062W,akeygenetictargetengineeredinthisstudy,onterpenoidsproductionwassystematicallyelucidated,andthebiologicalfunctionofYPL062Wwasre-annotatedaswell.Firstly,S.cerevisiaeCEN.PK2wasusedash
8、ostcellandinducibleheterologouslycopenepathwaywasintegrated.BycomparingtwostrategiesofincreasingtheinductionefficiencyofGALexpressionsystem(Δgal1Δgal7Δgal10andΔgal80)
