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分類號：R682.3單位代碼：10159密級：公開學號：201520256碩士學位論文中文題目：高濃度褪黑素調(diào)控Septin4蛋白介導成骨細胞凋亡的機制研究英文題目：MechanismsofSeptin4-mediatedapoptosisinducedbyhighconcentrationofmelatoninininhumanfetalosteoblasticcells1.19論文作者：趙思超指導教師：朱悅教授學科專業(yè)：外科學完成時間：2018年2月I 中國醫(yī)科大學碩士學位論文高濃度褪黑素調(diào)控Septin4蛋白介導成骨細胞凋亡的機制研究MechanismsofSeptin4-mediatedapoptosisinducedbyhighconcentrationofmelatoninininhumanfetalosteoblasticcells1.19論文作者趙思超指導教師朱悅教授申請學位醫(yī)學碩士培養(yǎng)單位第一臨床學院一級學科臨床醫(yī)學二級學科外科學研究方向骨科論文起止時間2016年3月—2018年2月論文完成時間2018年2月中國醫(yī)科大學（遼寧）2018年2月I 中國醫(yī)科大學碩士學位論文摘要目的：特發(fā)性脊柱側(cè)凸（IdiopathicScoliosis，IS）是生長發(fā)育期間原因未知的脊柱側(cè)凸，表現(xiàn)為一種三維的脊柱畸形，患病率呈上升趨勢，其長期威脅著患者的健康，可能導致許多不良結(jié)果，極大的降低人們的生活質(zhì)量。特發(fā)性脊柱側(cè)凸進展最快的時間，發(fā)生在少年生長發(fā)育最快的年齡，也就是骨骼發(fā)育、成骨細胞增殖最活躍的時間段。褪黑素可以影響骨代謝，有大量證據(jù)表明其可以影響特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進展。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，高濃度褪黑素可以顯著抑制成骨細胞增殖，介導其發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmicreticulumstress，ERS)甚至凋亡。因此，探討高濃度褪黑素介導成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及細胞凋亡的機制可能為治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸提供新的思路。外界刺激可導致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應以減輕細胞損傷，恢復細胞功能，然而過強或長時間的ERS，可引起細胞凋亡。有學者研究指出Septin4可能是ERS的感受器，作為ERS的靶點調(diào)控細胞的生理過程。Septin4蛋白被認為是細胞骨架的一部分，并且參與許多重要的細胞生理過程，如細胞轉(zhuǎn)運、有絲分裂、纖維化和細胞凋亡。有研究指出Septin4可以通過細胞凋亡途徑在小鼠腫瘤模型或者人類患者中抑制腫瘤發(fā)展，減弱由日本血吸蟲誘導的肝纖維化進程發(fā)展。然而，對于Septin4是否參與骨代謝疾病，比如褪黑素調(diào)節(jié)特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進展方面的研究，尚未有人報道。本研究的目的旨在明確Septin4在高濃度褪黑素介導成骨細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及細胞凋亡過程中的變化，探討其作用機制。從這項研究中獲得的信息可能對于探索使用褪黑素治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸提供新的視野和方向。研究方法：本實驗采用MTT法測定成骨細胞活力，使用AnnexinV-FITC/PI雙染細胞、流式細胞術(shù)分析凋亡和Westernblot檢測來明確Septin4參與高濃度褪黑素介導的人成骨細胞（hFOB1.19細胞）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及細胞凋亡中的變化。然后通過對Septin4過表達，解析其對高濃度褪黑素介導的人成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡的作用。此外，我們將應用鬼筆環(huán)肽染色纖維狀肌動蛋白，以探討過表達Septin4對高濃度褪黑素介導hFOB細胞骨架的影響以及細胞形態(tài)的變化。III 中國醫(yī)科大學碩士學位論文結(jié)果：1.高濃度褪黑素抑制hFOB1.19細胞的活力，促進細胞凋亡，增加Septin4、ERS和凋亡通路相關(guān)基因的表達。2.過表達Septin4加強高濃度褪黑素誘導人成骨細胞的細胞活力下降，促進細胞凋亡的能力，且增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡通路相關(guān)基因的表達。3.過表達Septin4加重人成骨細胞中由高濃度褪黑素誘導的細胞骨架的破壞以及細胞形態(tài)學變化的程度。結(jié)論：本研究證實Septin4參與并增強了由高濃度褪黑素介導的人成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡過程，加重高濃度褪黑素對成骨細胞細胞骨架的破壞以及細胞形態(tài)學變化的程度。關(guān)鍵詞：特發(fā)性脊柱側(cè)凸；人成骨細胞；Septin4蛋白；褪黑素；細胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；細胞骨架課題資助：國家自然科學基金（No.81472044）IV 中國醫(yī)科大學碩士學位論文AbstractBackgroundandobjective:Idiopathicscoliosis(IS)isanunknowncauseofscoliosisduringgrowthanddevelopment,whichpresentsasa3Ddeformityofthespinewithanincreasingprevalence.Thediseasethreatenthehealthofpatientsformanyyearsandmaycausemanyproblems.Asaresult,people'squalityoflifeisgreatlyreduced.Thefastesttimeforthedevelopmentofidiopathicscoliosisoccursinthefastestgrowingageofjuveniles,thatis,themostactiveperiodofbonedevelopmentandosteoblastproliferation.Melatonincanaffectbonemetabolism,andthereisalotofevidencethatitcanaffecttheprogressofidiopathicscoliosis.Ourpreviousstudyfoundthathighconcentrationsofmelatonincouldsignificantlyinhibittheproliferationofosteoblasts,mediatingendoplasmicreticulumstress(ERS)andevenapoptosis.Therefore,toexplorethemechanismofhighconcentrationsofmelatonin-mediatedERSandapoptosisinosteoblastsmayprovideanewideaforthetreatmentofidiopathicscoliosis.Externalstimulationcanleadtodisruptionofthephysiologicalfunctionoftheendoplasmicreticulum,triggeringERS.Endoplasmicreticulumcanreducecelldamageandrestorecellfunctionbyactivatingunfoldedproteinreaction.However,excessiveorprolongedERScaninduceapoptosis.SomescholarshaveconcludedthatSeptin4mayserveasareceptorofERStoregulatecellphysiology.Septin4isconsideredasapartofcytoskeletonandisinvolvedinmanyimportantcellularphysiologicalprocesses,suchascelltransport,mitosis,fibrosisandapoptosis.StudieshaveshownthatSeptin4caninhibittumordevelopmentinmousetumormodelsorhumanpatientsthroughtheapoptoticpathwayandattenuatetheprogressofhepaticfibrosisinducedbySchistosomajaponicumaswell.However,thestudyofwhetherSeptin4participatesinbonemetabolicdiseases,suchasmelatoninregulationofidiopathicscoliosis,hasnotbeenreportedyet.TheaimofthisstudywastodeterminethechangesandtoinvestigateitsmechanismwhenhighconcentrationsofmelatoninmediatingcellERSandcellapoptosisinhFOBcells.TheinformationobtainedfromthisstudymayprovideanewvisionanddirectionforexploringtheuseV 中國醫(yī)科大學碩士學位論文ofmelatonininthetreatmentofidiopathicscoliosis.Methods:MTTassaywasusedtodetermineosteoblastactivityinthisexperiment.AnnexinV-FITC/PIdoublestainingcellsandflowcytometrywereusedtoanalyzeapoptosisandWesternblotassaydetectiontoidentifySeptin4involvedinhighconcentrationsofmelatoninmediatedendoplasmicreticulumstressandapoptosisinhumanosteoblasts.ThenbyoverexpressionofSeptin4,theeffectsofhighconcentrationsofmelatoninmediatedendoplasmicreticulumstressandapoptosisinhumanosteoblastswereanalyzed.Inaddition,wewillusephalloidinstainingF-actin,todeterminetheeffectofSeptin4onhighconcentrationsofmelatonininducedhFOBcytoskeletonandchangesofcellmorphology.Results:1.HighconcentrationsofmelatonininhibitstheactivityofhFOB1.19cells,promotesapoptosis,andincreasestheexpressionofSeptin4,ERSandapoptosispathwayrelatedgenes.2.OverexpressionofSeptin4enhancedthedeclineofcellviabilityandapoptosisofhFOBcellsinducedbyhighconcentrationsofmelatonin,andtheexpressionofERSandapoptoticpathwayrelatedgenesalsoincreased.3.OverexpressionofSeptin4aggravatedthedestructionofcytoskeletonandthedegreeofcellmorphologicalchangesinducedbyhighconcentrationsofmelatonin.Conclusion:ThisstudyconfirmedthatSeptin4increasedtheprocessofendoplasmicreticulumstressandapoptosismediatedbyhighconcentrationsofmelatonininhumanosteoblasts,aggravatesthedegreeofthedestructionofosteoblastscytoskeletonandthechangeofcellmorphologyinducedbyhighconcentrationsofmelatonin.Keywords:Idiopathicscoliosis,HFOB1.19cells,Septin4,Melatonin,Apoptosis,Endoplasmicreticulumstress,CytoskeletonVI 中國醫(yī)科大學碩士學位論文英文縮略語英文縮寫英文全稱中文全稱ISIdiopathicscoliosis特發(fā)性脊柱側(cè)凸hFOB1.19HumanFetalOsteoblasticCells1.19人胎兒成骨細胞系1.19ERSEndoplasmicreticulumstress內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激UPRUnfoldedproteinresponse未折疊蛋白反應GRP78glucose-regulatedprotein78KD葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78BIPimmunoglobulinheavychainbindingprotein免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白DMSODimethylsulfoxide二甲基亞砜EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸二鈉3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)3-(4，5-二甲基噻-2）MTT-2,5-diphenyl-2，5-二苯基-2-H-tetrazoliumbromide四氮唑溴鹽PMSFPhenylmethanesulfonylfluoride苯甲基磺酰氟PBSPhosphatebuffersolution磷酸鹽緩沖液ECLEnhancedchemiluminescence增強化學發(fā)光DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚VII 中國醫(yī)科大學碩士學位論文目錄摘要............................................................................................................................IIIAbstract.........................................................................................................................V英文縮略語................................................................................................................VII1前言............................................................................................................................12材料與方法................................................................................................................32.1實驗材料及試劑.................................................................................................32.1.1細胞系培養(yǎng)與處理......................................................................................32.1.2抗體及主要實驗材料..................................................................................42.2主要設(shè)備與儀器.................................................................................................62.3實驗方法.............................................................................................................72.3.1細胞活性檢測...............................................................................................72.3.2細胞凋亡檢測..............................................................................................72.3.3Westernblot檢測相關(guān)蛋白..........................................................................82.3.4鬼筆環(huán)肽染色...............................................................................................92.3.5統(tǒng)計分析.......................................................................................................93結(jié)果..........................................................................................................................103.1高濃度褪黑素降低hFOB1.19細胞的活力，促進細胞凋亡........................103.2高濃度褪黑素對Septin4表達的作用..............................................................113.3高濃度褪黑素增加ERS和凋亡通路相關(guān)基因的表達...................................113.4過表達Septin4加強高濃度褪黑素抑制hFOB細胞活力和促進細胞凋亡123.5過表達Septin4增加高濃度褪黑素介導hFOB1.19細胞ERS和凋亡通路相關(guān)基因的表達..........................................................................................................143.6過表達Septin4增強高濃度褪黑素誘導hFOB1.19細胞細胞骨架的破壞以及細胞形態(tài)學變化的程度......................................................................................154討論..........................................................................................................................175結(jié)論..........................................................................................................................19本研究創(chuàng)新性的自我評價..........................................................................................20參考文獻......................................................................................................................21綜述............................................................................................................................26VIII 中國醫(yī)科大學碩士學位論文致謝............................................................................................................................33個人簡歷......................................................................................................................34IX 中國醫(yī)科大學碩士學位論文1前言脊柱側(cè)凸也稱作脊柱側(cè)彎，是一種三維的脊柱畸形,其表現(xiàn)不僅在矢狀位和冠狀位的序列上存在異常，在水平面也存在軸向旋轉(zhuǎn)[1]。脊柱側(cè)凸的典型表現(xiàn)為剃刀背，其具體表現(xiàn)為患者兩肩高低不平，身體前屈時背部一側(cè)隆起呈剃刀樣，一側(cè)胸廓塌陷而另一側(cè)隆起，同時可伴有骨盆傾斜和跛行，Cobb角超過10°可診斷脊柱側(cè)凸[2]。脊柱側(cè)凸如任其發(fā)展，最終可形成嚴重脊柱側(cè)凸，導致軀干嚴重畸形。特發(fā)性脊柱側(cè)凸（IdiopathicScoliosis，IS）是生長發(fā)育期間原因未知的脊柱側(cè)凸，約占脊柱側(cè)凸的70%-90%[3],其根據(jù)發(fā)病年齡主要分為三種類型：嬰兒型（0～3歲）；少兒型（3～10歲）；青少年型（10歲后）。青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸的患病率為0.47%-5.2%，且呈上升趨勢，其中女孩脊柱彎曲的發(fā)生率和嚴重程度要高于男孩[4]。青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸以Cobb角度的大小分型：當其小于10°時可以考慮為處在正常變異的范圍內(nèi)，因為它幾乎沒有發(fā)展的趨勢，10°-20°為輕型，20°-30°為中型，30°以上為重型[5]，嚴重的脊柱側(cè)凸長期威脅著患者的健康，可能導致許多不良結(jié)果，例如：背部疼痛，肺部疾病，殘疾，美觀問題，心理疾病等等，這些都極大的降低了人們的生活質(zhì)量[6]。目前已經(jīng)證實的是，骨的形成是通過一個連續(xù)運行的重塑過程來實現(xiàn)的，該過程涉及由破骨細胞吸收舊骨，隨后由成骨細胞形成新骨[7]。脊柱畸形的發(fā)展和脊柱的發(fā)育進程密不可分[8]。特發(fā)性脊柱側(cè)凸進展最快的時間，發(fā)生在少年生長發(fā)育最快的年齡，也就是骨骼發(fā)育、成骨細胞增殖最活躍的時間段[9-12]。還有報道指出：患有特發(fā)性脊柱側(cè)凸的女孩在糾正側(cè)凸導致的高度損失后，其站立身高明顯高于同齡的對照組人群的平均身高[13]。褪黑素可以影響骨代謝[14]，有大量證據(jù)表明其可以影響特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進展。Thillard報道了將雞的松果體切除，可誘導其發(fā)育出與人類特發(fā)性脊柱側(cè)凸相似的脊柱畸形[15]。后來，Machid等學者報道了在松果體切除術(shù)后的雙足脊椎動物模型或未進行松果體切除的、褪黑素缺乏的C57BL/6J雙足小鼠動物模型上，采用松果體的自體移植[16]或腹膜內(nèi)注射褪黑素[17]的方式可以在一定程度上減緩這些動物模型脊柱側(cè)凸的進展。不僅在實驗動物上，經(jīng)證實，青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸患者的血清褪黑素水平顯著低于對照組[18]，而且有研究表明，褪黑素的缺乏在特發(fā)性脊柱側(cè)凸的預后中起著關(guān)鍵作用，而褪黑素補充劑可以預防特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進展，特別1 中國醫(yī)科大學碩士學位論文是在角度小于35°的情況下[19]。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，褪黑素水平的降低與脊柱畸形的發(fā)展之間存在關(guān)聯(lián)。目前，褪黑素治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸具有不確定性[20]，這可能因為褪黑素的濃度與特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進展相關(guān)。我們前期的的研究發(fā)現(xiàn)，低濃度褪黑素促進成骨細胞增殖[21]，而高濃度褪黑素可以顯著抑制成骨細胞增殖[22]，介導其發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激甚至凋亡。因此，我們推測高濃度褪黑素介導成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡可能是其治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸的關(guān)鍵所在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是細胞內(nèi)十分重要的細胞器，同時它也是細胞重要的鈣離子貯存庫。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與許多重要的功能，如蛋白的折疊、合成、分泌以及轉(zhuǎn)譯后的修飾等，不僅如此，它還能調(diào)節(jié)細胞對外界應激的反應、細胞內(nèi)鈣離子的水平變化以及膽固醇的合成[23]。外界刺激可導致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡、鈣超載，而鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變和未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的蓄積可以引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmicreticulumstress，ERS)[24,25]，其包括鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔排空、糖基化抑制、二硫鍵結(jié)合減少、突變蛋白質(zhì)表達等過程。任何有害條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會導致降低蛋白合成，增加分子伴侶的表達,促進蛋白質(zhì)的正確折疊和細胞復蘇[26]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過激活未折疊蛋白反應(unfoldedproteinresponse，UPR)[27]以保護由ERS所引起的細胞損傷，恢復細胞功能，然而，過強或長時間的ERS，可引起細胞凋亡[28-30]。未折疊蛋白反應是由分子伴侶和3個感受蛋白介導的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶是GRP78/BIP,另外三個感受蛋白是PERK、IRE-1和ATF6。當無外界刺激或外界刺激程度不強時，PERK、ATF6、IRE-l與GRP78處于結(jié)合狀態(tài)，此時他們并無活性。然而當外界刺激程度增強導致產(chǎn)生ERS時，GRP78與3種跨膜蛋白解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合堆積產(chǎn)生的未折疊蛋白。感受蛋白此時被活化，激活未折疊蛋白反應，減少未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積累，這一過程可逐漸恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，所以說，這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的生存途徑[23,31-34],當外界刺激程度過于嚴重或者刺激時間過長以至于破壞了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能時，將會啟動由ERS所介導的凋亡信號通路，誘導細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與機體多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，這主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致細胞凋亡有關(guān)。其在骨細胞的生長、凋亡及相關(guān)骨病中，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。實驗發(fā)現(xiàn)在不同強度的ERS反應下，對成骨細胞有雙向調(diào)控作用[35]。有學者運用siRNAscreen技術(shù)發(fā)現(xiàn)，Septin4高表達于HeLa細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體膜表面，當受到2 中國醫(yī)科大學碩士學位論文外界刺激時，其在質(zhì)膜上迅速重新分布，引起細胞膜鈣離子內(nèi)流[36]，這提示Septin4可能是ERS的感受器，作為ERS的靶點調(diào)控細胞的生理過程。Septins蛋白家族最初在酵母中被發(fā)現(xiàn)，屬于一個高度保守的聚合GTP結(jié)合蛋白家族，長期以來一直被認為是細胞骨架的一部分[37]。已有文獻報道，Septins基因在除原生生物以及植物以外的大多數(shù)真核生物細胞中廣泛表達，比如真菌、果蠅和哺乳動物中，而且其基因序列在不同的物種之間具有很高的同源性[38]。Septin4從屬于Septins家族亞型，目前已經(jīng)證實，其存在于大多數(shù)真核生物細胞中，在人類，它位于染色體17q23[39]。Septin4具有多個剪接變體[40]，并且參與許多重要的細胞生理過程，如細胞轉(zhuǎn)運、有絲分裂、纖維化和細胞凋亡[41]。學者ElhasidRonit的研究報告指出，Sept4_i2/ARTS（Setpin4的兩種主要剪接變體之一）被證明可以通過細胞凋亡途徑在小鼠腫瘤模型或者人類患者中抑制腫瘤發(fā)展。不僅如此，研究還顯示Sept4_i2/ARTS缺陷小鼠因為其具有對凋亡的抵抗作用而導致促進了腫瘤的進展[42]。在DuanYN等學者的研究中，他們發(fā)現(xiàn)Septin4可通過細胞凋亡途徑減弱由日本血吸蟲誘導的肝纖維化進程發(fā)展[43-45]。此外還有研究顯示，在帕金森疾病模型中，Septin4的缺乏可通過減少多巴胺能神經(jīng)傳遞并且增強α-突觸核蛋白神經(jīng)毒性而顯著增加神經(jīng)病理學以及運動功能的惡化[46]。ParicioNuria的研究提示Septin4通過調(diào)節(jié)E3泛素連接酶Nedd4參與帕金森病[47]。然而，對于Septin4是否參與骨代謝疾病，比如褪黑素調(diào)節(jié)特發(fā)性脊柱側(cè)凸的進展方面的研究，尚未有人報道。2材料與方法2.1實驗材料及試劑2.1.1細胞系培養(yǎng)與處理正常人胎兒成骨細胞系hFOB1.19由SubramaniamMalayannan博士友情饋贈[48],hFOB細胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DME/F12（1:1）培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置于潮濕環(huán)境中含有5%CO2，37℃的恒溫箱中培養(yǎng)。細胞隔日換液，待細胞長滿，鋪滿培養(yǎng)瓶/培養(yǎng)皿單層后，使用含有0.02%EDTA的0.25%的胰蛋白酶在37℃環(huán)境下常規(guī)消化1-2min，再加入含血清培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，輕柔吹打成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度，傳代培養(yǎng)。成骨細胞在傳代培養(yǎng)8–11代中使用，在給予細胞處理因素前24小時處理細胞，使其密度在104個細胞/cm2。3 中國醫(yī)科大學碩士學位論文計算好量褪黑素用DMSO溶解后，再用含10%FBS的培養(yǎng)基定容至含0.2%DMSO和10%FBS的褪黑素溶液母液，然后再用含有0.2%DMSO和10%FBS的培養(yǎng)基稀釋至各個濃度（0mM，2mM，4mM和6mM）的褪黑素溶液。每次藥液現(xiàn)用現(xiàn)配。Flag-Septin4過表達質(zhì)粒的構(gòu)建與擴增購自上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司?；蛎Q：SEPT4(NM_004574)，物種：Human。載體名稱：GV141XhoI/KpnI酶切，元件順序：CMV-MCS-3FLAG-SV40-Neomycin。根據(jù)說明書計算轉(zhuǎn)染混合物中各個成分的用量，用Lipofectamine2000進行細胞轉(zhuǎn)染。因質(zhì)?；虻谋磉_在瞬轉(zhuǎn)后48h達到高峰，所以在轉(zhuǎn)染6h后細胞換液用褪黑素溶液作用細胞。褪黑素處理細胞42h后，收細胞用實驗檢測。細胞轉(zhuǎn)染效率用Westernblot檢測Flag及Septin4蛋白的表達來檢測。2.1.2抗體及主要實驗材料材料來源DME/F12(1:1)培養(yǎng)基HyClone,猶他，美國0.25％胰蛋白酶HyClone,猶他，美國胎牛血清（FBS）HyClone,猶他，美國ECLThermoFishercientific，美國蛋白彩虹markerThermoFisherScientific，美國DAPIsolarbio,中國MTTSigma，美國二甲基亞砜（DMSO）Sigma，美國牛血清蛋白（BSA）Sigma，美國Septin4plasmidsGenechem,上海，中國Lipofectamine2000Invitrogen,美國4 中國醫(yī)科大學碩士學位論文Opti-MEM培養(yǎng)基ThermoFisherScientific，美國鼠抗-Septin4抗體1:4000;abcam,上海，中國兔抗-GRP94抗體1:1000;abcam,上海，中國兔抗-GRP78抗體1:1000;abcam,上海，中國兔抗-caspase-3抗體1:1000;CellSignalingTechnology,美國鼠抗-Flag抗體1:1000;CellSignalingTechnology,美國鼠抗-β-actin抗體1:10000;proteintech,美國羊抗鼠第二抗體北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國羊抗兔第二抗體北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國PVDF膜Millipore，美國BCA蛋白定量試劑盒康為試劑，中國RIPA蛋白裂解液碧云天，中國PMSF碧云天，中國AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒Dojindo,日本丙烯酰胺索萊寶，中國TrisBase索萊寶，中國TEMED索萊寶，中國APS索萊寶，中國甘氨酸索萊寶，中國Tween20索萊寶，中國5 中國醫(yī)科大學碩士學位論文十二烷基磺酸鈉(SDS)索萊寶，中國培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、吸管等耗材CorningCoster，美國2.2主要設(shè)備與儀器儀器來源超凈工作臺SW-CJ-IF，蘇州，中國細胞培養(yǎng)箱Thermo，scientific，美國倒置顯微鏡Olympus，日本高速冷凍離心機STRATOSKENDRO，美國振蕩恒溫水浴鍋常州高德儀器制造有限公司，中國光譜掃描式微板分光光度計MOLECULARDEVICE，美國電泳儀Bio-rad，美國振蕩恒溫金屬浴儀Eppendorf，德國超純水器CascadaBio，美國壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠，中國多功能臺式搖床Eppendorf，德國電子稱量儀Sartorious，美國倒置熒光顯微鏡Olympus，日本漩渦振蕩器海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國立式超低溫保存冰箱青島海爾特種電器有限公司，中國6 中國醫(yī)科大學碩士學位論文立式醫(yī)用低溫冰箱中科美菱低溫科技有限責任公司，中國低速離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司，中國層析冷柜北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，中國2.3實驗方法2.3.1細胞活性檢測用MTT試劑盒檢測細胞活力。（1）將hFOB細胞以每孔6000個細胞的密度接種于96孔板，度過24h讓細胞貼壁后處理細胞。（2）處理方式：第一部分實驗單純用0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理hFOB細胞48h；第二部分實驗需要對細胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)?；騀lag-Septin4質(zhì)粒后再換液用褪黑素處理細胞，hFOB細胞隨機分為4組：1.轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒；2.轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒且暴露于褪黑素（2mM，4mM和6mM）；3.轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)粒；4.轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)粒且暴露于褪黑素（2mM，4mM和6mM），細胞轉(zhuǎn)染48h且褪黑素處理42h。（3）不同的處理因素作用于細胞后，各孔細胞換液為90μL新鮮培養(yǎng)基，加入配置好的10μlMTT溶液（5mg/ml），在37?C孵育4h后，小心棄上清液，然后各孔加入110μlDMSO。避光環(huán)境置于緩慢搖床低速震蕩10min。在490nm的波長用酶標儀測量每個孔的吸光度。各組成骨細胞的相對活力=（處理組孔的值-空白組的值）/（對照組的值-空白組的值），用5組獨立的實驗數(shù)據(jù)進行分析。2.3.2細胞凋亡檢測用AnnexinV-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡。（1）將hFOB細胞以每孔105個細胞的密度接種于6孔板，度過24h讓細胞貼壁后處理細胞。（2）處理方式：第一部分實驗單純用0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理hFOB細胞48h；第二部分實驗需要對細胞轉(zhuǎn)染對照質(zhì)?；騀lag-Septin4質(zhì)粒后再換液用褪黑素處理細胞，hFOB細胞隨機分為4組：1.轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒；2.轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒且暴露于4mM褪黑素；3.轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)粒；4.轉(zhuǎn)染Flag-Septin47 中國醫(yī)科大學碩士學位論文質(zhì)粒且暴露于4mM褪黑素，細胞轉(zhuǎn)染48h且褪黑素處理42h。（3）用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，（胰蛋白酶提前在37℃水浴箱內(nèi)預熱）在4°C環(huán)境下以1000rpm/min離心3min。（4）棄上清液，用冷PBS洗滌細胞2次，每次洗滌后在4°C環(huán)境下以1000rpm/min離心3min，棄上清。（5）各組細胞用500μlBindingbuffer重懸，轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)。各實驗組加入FITC（5μl）和PI（5μl）。懸浮液在室溫下孵育20min后用流式細胞儀分析。實驗重復3次。2.3.3Westernblot檢測相關(guān)蛋白（1）細胞按照上述方式分組，經(jīng)過處理后，提取總蛋白。在冰上用細胞刮刀輕柔刮取細胞，將細胞及殘存培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中，用冷PBS沖洗培養(yǎng)皿2次，將其一并收取至離心管中，在4°C環(huán)境下以2000rpm/min離心10min。棄上清液，用冷PBS洗滌細胞2次，每次洗滌后在4°C環(huán)境下以2000rpm/min離心10min，徹底吸取上清全部棄去。加入含有蛋白酶抑制劑的裂解液，重懸細胞置于冰上裂解30min，其中每經(jīng)過10min間斷用漩渦振蕩器將細胞混勻。在4°C以12000rpm/min離心20min提取上清。（2）用BCA法測定蛋白濃度，繪制蛋白標準曲線計算各組蛋白濃度。統(tǒng)一各組蛋白濃度，根據(jù)計算結(jié)果用無菌雙蒸水和6×LoadingBuffer稀釋蛋白樣品，每個樣品體積12μl，含蛋白60μg。用振蕩恒溫金屬浴儀在99℃以400rpm/min速度震蕩，加熱5min。瞬離各樣品后于-80°C保存?zhèn)溆?。?）電泳。根據(jù)說明書配置SDS-PAGE凝膠，分離膠濃度10%，上層濃縮膠凝固后置于潮濕環(huán)境保存?zhèn)溆?。配制電泳緩沖液：甘氨酸14.4g，Tris3.03g，SDS1g溶于1000ml雙蒸水，混勻后組裝垂直電泳裝置。蛋白樣品再次以400rpm/min速度震蕩，加熱5min后瞬離。電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，內(nèi)外槽無滲漏，小心拔出膠板內(nèi)梳子，選擇孔道小心加入5μl蛋白彩虹marker及各組全部12μl蛋白樣品，避免樣品溢出。正確連接電源，以80V恒電壓開始電泳，蛋白樣品及Marker電泳至分離膠后改變電壓為120V，直至樣品到底后終止。（4）轉(zhuǎn)膜。電泳過程中準備轉(zhuǎn)膜裝置，配制TransBuffer：甘氨酸14.4g，Tris3.03g，800ml雙蒸水，再加入200ml甲醇避免揮發(fā)于4℃預冷。打開轉(zhuǎn)印夾，兩面各放置海綿及3層潔凈濾紙，置于TransBuffer內(nèi)浸泡。電泳結(jié)束后，根據(jù)Marker位置及目的蛋白分子量的大小切取膠條，整齊放置于轉(zhuǎn)印夾黑色面濾紙上，以分子8 中國醫(yī)科大學碩士學位論文量50KD劃分大小，分別置于不同的轉(zhuǎn)印夾，并標記。根據(jù)膠條大小裁剪PVDF膜，標記后浸泡于甲醇中激活，再對應覆蓋再膠條上，主意貼合緊密完整無氣泡、雜質(zhì)。將三層濾紙及海綿順次放置于膜上，合上轉(zhuǎn)印夾，插入轉(zhuǎn)膜槽，倒入TransBuffer，放入冰盒。于4℃層析冷柜內(nèi)正確連接電極、電源，以80V恒壓持續(xù)轉(zhuǎn)膜，小分子量蛋白轉(zhuǎn)膜60min，大分子量90min，注意初始電流在200mA左右。（5）孵育抗體。用TBST溶液和BSA粉末配置5%BSA的封閉液和1%BSA的抗體孵育液。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，迅速用鑷子將PVDF膜轉(zhuǎn)至封閉液中，在緩慢搖床上封閉60-90min。按照說明書稀釋各目標蛋白抗體，將PVDF膜完全浸泡于抗體中在4℃環(huán)境中置于緩慢搖床孵育過夜。第二天取出PVDF膜，用TBST溶液在快速搖床下洗滌4次，每次15min，再將其浸泡于稀釋好的對應的二抗中。室溫下在緩慢搖床孵育2h，再用TBST溶液洗滌4次。（6）發(fā)光。根據(jù)膜的數(shù)量將ECL發(fā)光液A、B以1:1混勻，PVDF膜置于膠片上吸去水分，置于暗室，將混勻的發(fā)光液均勻點在膜上，發(fā)光分析。條帶用同內(nèi)參蛋白β-actin標準化，然后用ImageJ軟件（NIH，美國）測量灰度值分析。2.3.4鬼筆環(huán)肽染色用鬼筆環(huán)肽染色F-actin。（1）將hFOB細胞以每孔1.2×104個細胞的密度接種于24孔板，度過24h讓細胞貼壁后處理細胞。hFOB細胞隨機分為4組：1.轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒；2.轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒且暴露于4mM褪黑素；3.轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)粒；4.轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)粒且暴露于4mM褪黑素，細胞轉(zhuǎn)染48h且褪黑素處理42h。（2）細胞固定。處理后的細胞用PBS洗滌三次，用4%多聚甲醛在室溫固定30?min。（3）細胞打孔。用PBS洗滌細胞3次后，用0.1%的TritonX-100為固定好的細胞增加通透性，打孔15min。（4）染色。根據(jù)說明書配置1×鬼筆環(huán)肽工作溶液。洗滌細胞3次，用工作液在避光、室溫染色細胞30?min。細胞用PBS在搖床上洗滌3次，每次5min，以去除多余的鬼筆環(huán)肽。用DAPI在避光、室溫進行細胞核染色30min，再用PBS洗滌細胞三次。最后，用熒光顯微鏡觀察細胞并拍攝。2.3.5統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)來自至少三個獨立的實驗，并利用GraphPadPrism5軟件分析。采用9 中國醫(yī)科大學碩士學位論文獨立樣本t檢驗或單因素方差分析（方差分析）對不同治療組之間的數(shù)據(jù)差異進行評價。所有數(shù)據(jù)均表示為平均±標準偏差，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。3結(jié)果3.1高濃度褪黑素降低hFOB1.19細胞的活力，促進細胞凋亡為了確定高濃度褪黑素對hFOB1.19細胞活力的影響，同時也為了明確各個濃度梯度對成骨細胞活力的作用情況，我們首先使用MTT分析檢測細胞活力。用0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理hFOB細胞48h，如圖1a所示，細胞存活率隨著褪黑素的濃度的增加而降低。隨后，我們用AnnexinV-FITC/PI雙染色細胞，再用流式細胞術(shù)分析了高濃度梯度褪黑素作用成骨細胞誘導其凋亡的變化。圖1b顯示hFOB細胞凋亡的程度明顯隨著褪黑素濃度的提高而升高。10 中國醫(yī)科大學碩士學位論文圖1高濃度褪黑素抑制hFOB1.19細胞活力，促進細胞凋亡（A）0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理hFOB細胞48h，MTT法檢測細胞活力。高濃度褪黑素顯著抑制成骨細胞活力，且呈劑量依賴關(guān)系。（B）流式細胞術(shù)分析顯示高濃度褪黑素顯著的促進了細胞的早期凋亡（Q4區(qū)域），且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果與對照組相比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.2高濃度褪黑素對Septin4表達的作用為了探究Septin4在骨代謝疾病中的意義，我們隨后分析了高濃度褪黑素在hFOB細胞中對Septin4表達變化的影響。圖2顯示對Septin4的表達隨著褪黑素濃度的升高而顯著增加，然而值得主意的是，當褪黑素的刺激太強（6mM）的時候，它的表達明顯減少。因此，我們的研究結(jié)果表明，Septin4在高濃度褪黑素介導hFOB細胞凋亡時，潛在發(fā)生了重要作用。圖2高濃度褪黑素對Septin4的作用0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理hFOB細胞48h，westernblot顯示，與未處理的對照組相比，高濃度褪黑素（2mM，4mM和6mM）作用hFOB細胞48h顯著增加Septin4表達，當褪黑素濃度為6mM時，Septin4的表達明顯減少。結(jié)果與對照組相比較，***p<0.0013.3高濃度褪黑素增加ERS和凋亡通路相關(guān)基因的表達此外，我們還分析了高濃度褪黑素在hFOB細胞中對ERS（GRP78、GRP94）11 中國醫(yī)科大學碩士學位論文和細胞凋亡（Caspase-3）途徑相關(guān)基因的表達。圖3顯示GRP78、GRP94和Caspase-3的表達隨著褪黑素濃度的升高而顯著增加，高濃度褪黑素介導hFOB細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡，且程度與濃度正相關(guān)。圖3高濃度褪黑素增加GRP78、GRP94和caspase-3的表達0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理hFOB細胞48h，westernblot顯示與未處理的對照組相比，GRP78、GRP94和caspase-3蛋白的表達顯著提高且呈劑量依賴性。結(jié)果與對照組相比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.4過表達Septin4加強高濃度褪黑素抑制hFOB細胞活力和促進細胞凋亡為了進一步地研究Septin4如何參與高濃度褪黑素誘導hFOB1.19細胞的損傷，同時也為了選擇褪黑素適當?shù)臐舛龋覀冇肍lag-Septin4質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染12 中國醫(yī)科大學碩士學位論文hFOB細胞48h，用0mM，2mM，4mM和6mM的褪黑素作用hFOB細胞42h。圖4a顯示，與轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)染了Flag-Septin4質(zhì)粒的細胞活力進一步被抑制，而且當褪黑素的濃度是4mM的時候，這一現(xiàn)象更為明顯。所以我們選擇4mM濃度的褪黑素作為最佳實驗條件。隨后，用AnnexinV-FITC/PI雙染色細胞后，再用流式細胞術(shù)分析褪黑素誘導成骨細胞凋亡的情況，如圖4b所示，與轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒的細胞相比，轉(zhuǎn)染了Flag-Septin4質(zhì)粒的細胞凋亡被顯著提高。因此，研究結(jié)果提示，Septin4顯著增強高濃度褪黑素抑制hFOB細胞活力和促進細胞凋亡的能力。圖4Septin4顯著加強高濃度褪黑素抑制hFOB細胞活力和促進細胞凋亡（A）0mM，2mM，4mM和6mM濃度的褪黑素處理轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒的hFOB細胞42h.MTT結(jié)果顯示過表達Septin4進一步抑制hFOB細胞活性。（B）0mM和4mM濃度的褪黑素處理轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒的hFOB細胞42h，流式細胞術(shù)13 中國醫(yī)科大學碩士學位論文分析表明，過表達Septin4加重了高濃度褪黑素誘導的細胞早期凋亡（Q4區(qū)）。結(jié)果與NC組相比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.5過表達Septin4增加高濃度褪黑素介導hFOB1.19細胞ERS和凋亡通路相關(guān)基因的表達此外，我們接著分析了過表達Septin4對高濃度褪黑素在hFOB1.19細胞中介導ERS和凋亡通路相關(guān)基因表達的影響。用Flag-Septin4質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒轉(zhuǎn)染hFOB細胞48h，用0mM和4mM褪黑素作用hFOB細胞42h。如圖5所示，與轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒的細胞相比，在轉(zhuǎn)染了Flag-Septin4質(zhì)粒的細胞中，ERS途徑（GRP78、GRP94）和細胞凋亡（caspase-3）相關(guān)基因的表達皆有明顯增加。因此，研究結(jié)果表明，Septin4在高濃度褪黑素誘導hFOB細胞ERS和凋亡中發(fā)揮了巨大作用。圖5過表達Septin4加強高濃度褪黑素介導hFOB1.19細胞ERS和細胞凋亡通路相關(guān)基14 中國醫(yī)科大學碩士學位論文因的表達0mM和4mM濃度的褪黑素處理轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒的hFOB細胞42h，Westernblot分析表明，1.與轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒的細胞相比，在轉(zhuǎn)染了Flag-Septin4質(zhì)粒的細胞中，F(xiàn)lag及Septin4的表達顯著增強，說明成功建立了有效的Septin4過表達。2.高濃度褪黑素作用hFOB后，GRP78、GRP94和Caspase-3蛋白在過表達Septin4的細胞中表達顯著增加。結(jié)果與NC組相比較，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.0013.6過表達Septin4增強高濃度褪黑素誘導hFOB1.19細胞細胞骨架的破壞以及細胞形態(tài)學變化的程度為了確定高濃度褪黑素是否能導致細胞骨架的破壞，我們應用鬼筆環(huán)肽染色纖維狀肌動蛋白（F-actin），用DAPI進行細胞核染色，隨后應用熒光顯微鏡進行分析。圖6表明，在未用褪黑素處理組，肌動蛋白是沿著hFOB細胞的軸線排列，形態(tài)有序，細胞形態(tài)規(guī)則呈梭形。當細胞暴露于4mM褪黑素42h后，肌動蛋白微絲變得排列無序、模糊甚至被破壞，此外，細胞的形狀變大且不規(guī)則呈多角形，同時細胞數(shù)目也明顯減少。統(tǒng)計分析表明，與轉(zhuǎn)染空白對照質(zhì)粒的細胞相比，這種情況在過表達Septin4的細胞中加劇了。因此，研究結(jié)果表明，過表達Septin4增加高濃度褪黑素誘導hFOB1.19細胞細胞骨架的破壞。15 中國醫(yī)科大學碩士學位論文圖6過表達Septin4增加高濃度褪黑素對hFOB胞細骨架的破壞（A）0mM和4mM濃度的褪黑素處理轉(zhuǎn)染Flag-Septin4質(zhì)?；蚩瞻讓φ召|(zhì)粒的hFOB細胞42h，F(xiàn)-actin用鬼筆環(huán)肽染色，DAPI進行細胞核染色標記。然后每組將這兩張照片融合。16 中國醫(yī)科大學碩士學位論文熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與對照組相比，高濃度褪黑素作用后，過表達Septin4的細胞形態(tài)不規(guī)則、數(shù)量減少以及細胞骨架的破壞都加劇了。（B）為圖片的局部放大，黃色箭頭所示可見尚存在的F-actin細胞骨架；紅色箭頭所示細胞骨架被破壞。柱狀圖顯示為細胞骨架被破壞的細胞占總細胞的百分比，結(jié)果與NC組相比較，**p<0.01。4討論尋找特發(fā)性脊柱側(cè)凸的發(fā)病機制，以及針對性做出有效的預防和診療仍然是脊柱矯形醫(yī)生的難題[49]，在未來藥物治療可能作為手術(shù)治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸的輔助手段。研究表明特發(fā)性脊柱側(cè)凸進展情況與患者生長發(fā)育時期相對應，疾病進展最快出現(xiàn)在骨骼快速發(fā)育、成骨細胞增殖最活躍的時間段[12]，而且經(jīng)證實，褪黑素水平與特發(fā)性脊柱側(cè)凸有密切聯(lián)系[18]，這可能與褪黑素調(diào)控成骨細胞的增殖或凋亡有關(guān)。在之前的研究中，我們證實褪黑素對成骨細胞增殖發(fā)揮劑量依賴性效應，低濃度褪黑素促進成骨細胞增殖，而高濃度褪黑素顯著抑制成骨細胞活力[21,22]。這些發(fā)現(xiàn)提示了褪黑素在預防和逆轉(zhuǎn)特發(fā)性脊柱側(cè)凸進展中可能的臨床應用。在既往的研究中，大量證據(jù)表明低濃度褪黑素通過促進成骨的方式調(diào)節(jié)骨代謝，其主要應用于增加骨重塑、促進骨折或骨缺損的修復和對抗骨質(zhì)疏松方面[7]。然而在高濃度褪黑素介導成骨細胞凋亡，尤其是治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸方面則鮮有報道。我們希望通過研究證明是否可以應用高濃度褪黑素誘導成骨細胞增殖抑制或凋亡來緩解、減輕脊柱側(cè)凸的進展，因此我們研究了高濃度褪黑素引起成骨細胞ERS和細胞凋亡的機制。在本研究中我們果然發(fā)現(xiàn)了高濃度褪黑素促進成骨細胞凋亡，并且在這個藥物作用過程當中，我們發(fā)現(xiàn)了Septin4蛋白表達的變化。這說明在這個誘導過程中，Septin4參與并且發(fā)揮了重要作用。所以我們的研究得出結(jié)論：高濃度褪黑素導致成骨細胞凋亡是通過Septin4完成這一進程。我們的研究首次提出高濃度褪黑素通過調(diào)控Septin4介導hFOB1.19細胞ERS和細胞凋亡,甚至第一次提出Setpin4參與骨代謝疾病。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Setpin4的表達水平在高濃度褪黑素介導人成骨細胞凋亡中顯著增加，有趣的是，當褪黑素的刺激太強（6mM）的時候，Septin4的表達反而明顯減少。這種情況與其他學者在應用脂多糖（LPS）誘導人肝星形細胞（LX-2細胞）中Septin4表達的變化趨勢類似[41]。由于Septin4作為細胞骨架廣泛存在于大多數(shù)真核生物細胞中，我們考慮這種情況的發(fā)生可能是由于外界刺激過強，導致成骨細胞的細胞骨架破壞過于嚴重，17 中國醫(yī)科大學碩士學位論文蛋白崩解所致。為了進一步明確Septin4在高濃度褪黑素誘導成骨細胞損傷模型中的作用，我們進行了轉(zhuǎn)染過表達Setpin4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其誘導的成骨細胞損傷進一步加劇，具體體現(xiàn)為細胞活力進一步降低，細胞凋亡加重、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（GRP78、GRP94）及凋亡（Caspase-3）相關(guān)通路蛋白的表達都有顯著的增高。此外，為了探索Septin4參與高濃度褪黑素與細胞骨架破壞的相關(guān)性，我們應用鬼筆環(huán)肽染色纖維狀肌動蛋白，DAPI染色標記細胞核，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞骨架的破壞，細胞形態(tài)學的改變以及細胞數(shù)量的減少這些情況都在成骨細胞過表達Septin4后加重了。因此我們的研究結(jié)果意味著Septin4蛋白在參與高濃度褪黑素介導人成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激以及細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，這可能為治療骨代謝疾病比如特發(fā)性脊柱側(cè)凸提供新的思路和視野。Setpin4，作為具有GTP酶的活性Septins家族的一個亞型，是細胞骨架的基本組成部分，其具有多種剪接變體[50]。PNUTL2和ARTS是Setpin4的兩種主要蛋白質(zhì)同種型。ARTS被認為是參與TGF-β信號通路誘導細胞凋亡的關(guān)鍵性分子之一,是一種白血病抑癌基因[51]。Elhasid指出Septin4(ARTS)是通過特異性拮抗XIAP促進細胞凋亡的腫瘤抑制蛋白[52]。ARTS中的P-loopGTPase域的重要性不僅在于其維持其核心結(jié)構(gòu)，也在于他能夠和其他的凋亡信號蛋白相互作用[50]，然而，Septin4能與哪些凋亡信號蛋白互相作用我們不甚了解。有學者報道Septin4可通過調(diào)節(jié)肝癌細胞的細胞凋亡抑制肝癌[53]，還有學者報道Septin4可通過細胞凋亡途徑減弱由日本血吸蟲誘導的肝纖維化進程發(fā)展[44]。一些研究表明Septin4（ARTS）可加重由TGF-β，依托泊苷和星形孢菌素誘導的細胞死亡，Septin4參與由CCl4和BDL引起抑制肌纖維母細胞轉(zhuǎn)化和肝纖維化的調(diào)節(jié)[54]。而我們是首次發(fā)現(xiàn)Septin4通過細胞凋亡途徑調(diào)節(jié)骨代謝。我們的研究為治療成骨細胞異常增殖的疾病提供了新的方向，然而我們存在不足之處。我們首先在骨代謝疾病中提出Septin4的促進凋亡作用，但是在其他骨科疾病比如針對骨腫瘤的作用尚未揭示。我們首次報道Septin4在成骨細胞中導致凋亡，但是Septin4能與哪寫凋亡信號蛋白共同作用我們不得而知，褪黑素調(diào)控Septin4促進成骨細胞凋亡、延緩脊柱側(cè)凸進展尚需動物疾病模型上繼續(xù)驗證，我們將會在后續(xù)的研究中繼續(xù)探究解析。18 中國醫(yī)科大學碩士學位論文5結(jié)論本研究證實Septin4參與并增強了由高濃度褪黑素介導的人成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和細胞凋亡過程，加重高濃度褪黑素對成骨細胞細胞骨架的破壞以及細胞形態(tài)學變化的程度。19 中國醫(yī)科大學碩士學位論文本研究創(chuàng)新性的自我評價我們的研究首次提出Setpin4參與并增強高濃度褪黑素介導hFOB1.19細胞ERS和細胞凋亡，提示Setpin4參與骨代謝疾病，推測其可能為治療特發(fā)性脊柱側(cè)凸的新機制，為治療成骨細胞異常增殖的疾病提供了新的方向。20 中國醫(yī)科大學碩士學位論文參考文獻[1]HeChen,ToMichaelKai-Tsun,CheungJasonPui-Yin,etal.Aneffectiveassessmentmethodofspinalflexibilitytopredicttheinitialin-orthosiscorrectiononthepatientswithadolescentidiopathicscoliosis(AIS)[J].PLOSONE,2017,12(12):e0190141.[2]GrauersA,EinarsdottirE,GerdhemP.Geneticsandpathogenesisofidiopathicscoliosis[J].Scoliosisandspinaldisorders,2016,11:45.[3]LetellierK,AzeddineB,BlainS,etal.Etiopathogenesisofadolescentidiopathicscoliosisandnewmolecularconcepts[J].MS-MEDECINESCIENCES,2007,23(11):910-916.[4]LangensiepenS,StarkC,SobottkeR,etal.Home-basedvibrationassistedexerciseasanewtreatmentoptionforscoliosis-Arandomisedcontrolledtrial[J].JOURNALOFMUSCULOSKELETAL&NEURONALINTERACTIONS,2017,17(4):259-267.[5]AsherMarcA,BurtonDouglasC.Adolescentidiopathicscoliosis:naturalhistoryandlongtermtreatmenteffects.[J].Scoliosis,2006,1(1):2-11.[6]GrossmanDavidC,CurrySusanJ,OwensDouglasK,etal.ScreeningforAdolescentIdiopathicScoliosisUSPreventiveServicesTaskForceRecommendationStatement[J].JAMA-JOURNALOFTHEAMERICANMEDICALASSOCIATION,2018,319(2):165-172.[7]CardinaliDP,LadizeskyMG,BoggioV,etal.Melatonineffectsonbone:experimentalfactsandclinicalperspectives.JPinealRes2003,34:81–87.[8]SarwarkJ,AubinCE.Growthconsiderationsoftheimmaturespine.JBoneJointSurgAm2007,89:8–13.[9]Sanchez-BarceloEJ,MediavillaMD,TanDX,etal.Scientificbasisforthepotentialuseofmelatonininbonediseases:osteoporosisandadolescentidiopathicscoliosis.[J].Journalofosteoporosis2010;2010:830231.[10]HeftiFL,McMasterMJ.Theeffectoftheadolescentgrowthspurtonearlyposteriorspinalfusionininfantileandjuvenileidiopathicscoliosis.[J].TheJournalofboneandjointsurgery.Britishvolume,1983,65(3):247-254.[11]SongKM,LittleDG.Peakheightvelocityasamaturityindicatorformaleswithidiopathicscoliosis[J].JOURNALOFPEDIATRICORTHOPAEDICS,2000,20(3):286-288.[12]LatalskMichal,Danielewicz-BromberekA,FatygaM,etal.Currentinsightsintotheaetiologyofadolescentidiopathicscoliosis[J].ARCHIVESOFORTHOPAEDICANDTRAUMASURGERY,21 中國醫(yī)科大學碩士學位論文2017,137(10):1327-1333.[13]YlikoskiM.Heightofgirlswithadolescentidiopathicscoliosis.EurSpineJ2003,12:288–291.[14]StHilaireMelissaA,RahmanShadabA,GooleyJoshuaJ,etal.Journalofboneandmineralmetabolism(2018).https://doi.org/10.1007/s00774-017-0896-6.[15]ThillardMJ.Deformationsdelacollonevertebraleconsecutivesal’epiphysictomiechezlepoussin.CRAssocAnat1959,46:22–26.[16]MachidaM,DuboussetJ,ImamuraY,etal.Anexperimentalstudyinchickensforthepathogenesisofidiopathicscoliosis.Spine1993,18:1609–1615.[17]MachidaM,DuboussetJ,ImamuraY,etal.Roleofmelatonindeficiencyinthedevelopmentofscoliosisinpinealectomisedchickens.JBoneJointSurgBr1995,77:134–138.[18]Sadat-AliM,AlHabdanI,AlOthmanA.Adolescentidiopathicscoliosis.Islowmelatoninacause?JointBoneSpine2000,67:62–64.[19]MachidaM,DuboussetJ,YamadaT,etal.Serummelatoninlevelsinadolescentidiopathicscoliosispredictionandpreventionforcurveprogression–aprospectivestudy.JPinealRes2009,46:344–348.[20]GirardoM,BettiniN,DemaE,etal.Theroleofmelatonininthepathogenesisofadolescentidiopathicscoliosis(AIS).EurSpineJ[J].2011,20(Suppl1):68-74.[21]XiongXiao-Chuan,ZhuYue,GeRui,etal.EffectofMelatoninontheExtracellular-RegulatedKinaseSignalPathwayActivationandHumanOsteoblasticCellLinehFOB1.19Proliferation[J].INTERNATIONALJOURNALOFMOLECULARSCIENCES,2015,16(5):10337-10353.[22]LiuLifeng,ZhuYue,XuYing,etal.MelatonindelayscellproliferationbyinducingG(1)andG(2)/MphasearrestinahumanosteoblasticcelllinehFOB1.19[J].JOURNALOFPINEALRESEARCH,2011,50(2):222-231.[23]SalminenAntero,KauppinenAnu,etal.ERstressinAlzheimer'sdisease:anovelneuronaltriggerforinflammationandAlzheimer'spathology.JournalofNeuroinflammation.20096:41.[24]ZhangK,KaufmanRJ.Fromendoplasmic-reticulumstresstotheinflammatoryresponse.Nature.2008,454(7203):455-62.[25]KawaguchiS,NgDT.Cellbiology.SensingERstress.Science.2011,333(6051):1830-1.[26]MatusS,GlimcherLH,HetzC.Proteinfoldingstressinneurodegenerativediseases:aglimpseintotheER.CurrOpinCellBiol.201123:239–252.[27]MartinSchr?der.TheUnfoldedProteinResponse[J].MolBiotechnol，2006,34（2）：279-290.22 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中國醫(yī)科大學碩士學位論文[54]IwaisakoKeiko,HatanoEtsuro，TauraKojiro,etal.LossofSept4exacerbatesliverfibrosisthroughthedysregulationofhepaticstellatecells[J].JournalofHepatology,2008,49(5):768–778.25 中國醫(yī)科大學碩士學位論文綜述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的研究進展[摘要]細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)細胞進程重要的細胞器：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，ER)，它同時也作為重要的鈣離子貯存場所而存在。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有幾個重要的功能，例如蛋白的合成、折疊、分泌和轉(zhuǎn)譯后修飾等，它參與調(diào)節(jié)細胞對外界應激的反應，還有細胞內(nèi)鈣水平變化和膽固醇的合成[1]。外界刺激導致細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能發(fā)生紊亂，引起鈣穩(wěn)態(tài)失衡、鈣超載，這將導致鈣穩(wěn)態(tài)的失衡。這種變化將引發(fā)錯誤折疊或者未折疊的蛋白質(zhì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmicreticulumstress，ERS)[2,3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激包括二硫鍵結(jié)合減少、突變蛋白質(zhì)表達、鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔排空、糖基化抑制等一系列的病理生理過程。任何有害條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會導致降低蛋白合成，增加分子伴侶的表達,促進蛋白質(zhì)的正確折疊和細胞復蘇[4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減輕細胞損傷的途徑主要通過激活未折疊蛋白反應（UPR）[5]，甚至進而回復細胞功能。然而，過強或長時間的ERS，可引起細胞凋亡[6-8]。[關(guān)鍵詞]:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激凋亡疾病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的生存途徑未折疊蛋白反應是由分子伴侶和3個感受蛋白介導的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶是GRP78/BIP,另外三個感受蛋白是PERK、IRE-1和ATF6。當無外界刺激或外界刺激程度不強時，PERK、ATF6、IRE-l與GRP78處于結(jié)合狀態(tài)，此時他們并無活性。然而當外界刺激程度增強導致產(chǎn)生ERS時，GRP78與3種跨膜蛋白解離，轉(zhuǎn)而去結(jié)合堆積產(chǎn)生的未折疊蛋白。感受蛋白此時被活化，激活未折疊蛋白反應，減少未折疊或錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的積累，這一過程可逐漸恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，所以說，這是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的生存途徑[1,9-12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡途徑上述三種感受蛋白不僅能夠啟動ERS的生存途徑，當外界刺激程度過于嚴重或者刺激時間過長以至于破壞了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能時，PERK、IRE-1和ATF6信號通路將繼續(xù)啟動由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細胞凋亡途徑。這一過程導致的結(jié)果就是：損傷過重的細胞因被誘導凋亡而死去，然后對于整體器官甚至生物來講，將得到保護。這三個感受蛋白并非直接引起細胞凋亡的，他們需要通過激活下游的凋亡信號分子，如26 中國醫(yī)科大學碩士學位論文CHOP、JNK、caspase-12以及Bcl-2家族等等。Caspase-12被證實為參與且唯一參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激導致細胞凋亡的關(guān)鍵因子。其處于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起凋亡的途徑中不發(fā)生變化。研究表明，Caspase-12基因缺陷鼠可以抵抗由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑導致的凋亡途徑，但是對于其他途徑如線粒體凋亡途徑引起的凋亡，并無明顯抵抗力，以上證據(jù)表明caspase-12僅與ERS介導凋亡的途徑有關(guān)，并且和非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡不發(fā)生關(guān)系。簡而言之，Caspase-12僅作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的唯一下游蛋白而存在。Caspase-12和其家族其他的caspase一樣，保持以無活性的酶原形式。過強的外界刺激導致ERS，進而激活caspase-12，cleaved-caspase-12隨即激活caspase-9，一系列的反應最終激活caspase-3這一凋亡途徑的總蛋白，最終導致細胞凋亡。Caspase-12不依賴Cytochrome[9，13]C或Apaf-1這些線粒體凋亡途徑蛋白對下游蛋白進行激活。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與了多種疾病進程，與他們都是牢不可分的。這主要因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以通過調(diào)控細胞凋亡來影響許多疾病的進程。如一些神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病、代謝性疾病、心血管疾病、骨科疾病、腫瘤等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與于阿爾茨海默病阿爾茨海默?。ˋlzheimer’sdisease,AD)又叫做老年癡呆，占癡呆患者近80%，[14、15]是最常見的癡呆類型。其病理特征性病理表現(xiàn)為：細胞外β-淀粉樣蛋白沉積和細胞內(nèi)微管關(guān)聯(lián)蛋白高度磷酸化導致的神經(jīng)纖維化纏結(jié)。其鏡下病理改變可見大量神經(jīng)元和突觸丟失。有研究顯示，家族阿爾茨海默病(FAD)與淀粉樣蛋白前體基因、早老因子-1(presenil-1，PS1)基因、早老因子-2基因的突變有關(guān)[16]。PS1是作為與AD有關(guān)的關(guān)鍵因子，是一種跨膜蛋白質(zhì)且主要存在于ER，其基因的突變使細胞對各種外界刺激誘導的細胞損傷的敏感性加強。由于GRP78mRNA的誘導，PS1突變型人成神經(jīng)細胞瘤SK-N-SH細胞的表達增加了細胞對衣霉素或鈣離子載體誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的敏感性。有證據(jù)表明，F(xiàn)AD相關(guān)PS1突變體可能通過抑制IRE-1和ATF6而阻止UPR的激活，還可干擾PERK的激活，表明PS1突變體可影響正常細胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的反應，從而影響FAD的發(fā)生。也有文獻報道針對以上機制應用白藜蘆醇衍生物預防和/或治療如阿爾茨海默病這些神經(jīng)退行性疾病[17-21]。不僅在阿爾茨海默氏癥，越來越多的證據(jù)表明，ERS可能在其他一些急性和慢性神經(jīng)退行性疾病中的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，如腦出血、帕金森病、朊病毒疾病以27 中國醫(yī)科大學碩士學位論文及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥等[22-24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與糖尿病及心血管疾病糖尿病(DM)特征是由于胰島素分泌缺陷導致的高血糖癥，且常伴有高脂血癥。如果細胞遭受不利的條件,包括過多的葡萄糖、感染、缺氧、缺血或血管緊張素II的刺激,ER的體內(nèi)平衡破壞,導致多個展開或錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累，這導致隨后的UPR及ERS[25]。如果持續(xù)的高血糖,ERS是長期的,當細胞不能解除應激，他們講導致細胞凋亡[26]。Caspase通路也通常導致ERS,尤其是caspase-12,雖然確切的機制還有待闡明。已經(jīng)有報告指出心臟疾病中由ERS導致的重要機制，ERS參與各種心血管疾病的發(fā)病機制,包括冠心病、心肌缺血再灌注損傷、心肌病和心力衰竭[27-30]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與骨科疾病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激同樣在骨細胞的生長、凋亡及相關(guān)骨病中，發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。骨髓間充質(zhì)干細胞可以分化成多種細胞系并且可以產(chǎn)生一個或多個定向祖細胞。ERS可以影響并增強其向成骨細胞分化的能力[31]。由于不同強度的外界刺激產(chǎn)生不同強度的ERS,導致其對成骨細胞有雙向調(diào)節(jié)作用，ERS通過ATF4／CHOP信號通路影響并增強成骨細胞的分化和生長能力[32]。有學者發(fā)現(xiàn)，當ERS被抑制后，破骨細胞的增殖受到明顯抑制[33]，ERS通過細胞白介素介導RANKL途徑調(diào)控破骨細胞的增殖分化。因此，探究成骨/破骨細胞協(xié)調(diào)增殖分化的分子機制尤其重要，這將會對治療骨相關(guān)疾病尤其是骨代謝疾病起到重要作用。軟骨組織是結(jié)締組織的一種，在機體中起到支撐、緩沖、減少關(guān)節(jié)面阻力作用。ERS影響正常軟骨細胞的分化，然而過強的外界刺激引發(fā)ERS，會導致軟骨發(fā)育異常。ERS還可介導軟骨細胞凋亡，加速軟骨退變進程，研究發(fā)現(xiàn)在這些過程中，CHOP、BMP2等因子表達量明顯提高[34]。骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是由于多種原因?qū)е碌膯挝惑w積骨量減少（骨密度和骨質(zhì)量下降），造成骨脆性增加，從而極易發(fā)生骨折的全身性骨代謝疾病。有學者對成骨細胞行氧化應激造模，檢測ERS標記蛋白、成骨細胞活力以及成骨細胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)活性氧通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑對成骨細胞的影響存在雙向調(diào)節(jié)：低濃度促進成骨細胞增殖，反之誘導成骨細胞凋亡[35]。地方性氟中毒，是由于長期攝入過量氟元素而引發(fā)的一種慢性全身性疾病，可表現(xiàn)為氟骨癥和氟斑牙，導致慢性骨代謝疾病。最近研究發(fā)現(xiàn)，氟元素通過ERS途徑對成骨細胞也存在雙向調(diào)節(jié)：低濃度的氟劑刺激成骨細胞增殖，但高劑量氟的細胞毒性作用會通過ERS途徑誘導成骨細胞凋亡[36]。成骨不全(OsteogenesisImperfecta，OI)是一種是一種少見的先28 中國醫(yī)科大學碩士學位論文天性骨骼發(fā)育障礙性疾病，又稱脆骨病，也是結(jié)締組織異常遺傳病。患者骨骼發(fā)育障礙是由基因突變導致的。病理特征為造成膠原形成障礙和骨纖維結(jié)構(gòu)異常。異常膠原蛋白大量堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，作為強力外界刺激導致ERS和細胞自噬，ERS通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬參與疾病，降解異常的膠原分子和前膠原蛋白[37]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與腫瘤的治療有文獻報道，應用依地福新治療尤文肉瘤，使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積累，觸發(fā)ERS，,最終導致Caspase激活腫瘤細胞凋亡[38,39]。此外，還有研究應用三硝基甲苯在人原發(fā)性肝癌細胞（HePG2）中誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和凋亡[40]。結(jié)語內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在各種疾病中的具體的分子機制還不夠完善，需要加強，未來是否可以通過尋找ERS在各種疾病中作用機制的靶點,進而為我們在治療疾病中提供新的視角，這是我們未來的研究方向。參考文獻[1]SalminenAntero,KauppinenAnu,etal.ERstressinAlzheimer'sdisease:anovelneuronaltriggerforinflammationandAlzheimer'spathology[J].Journalofeuroinflammation.20096:41.[2]ZhangK,KaufmanRJ.Fromendoplasmic-reticulumstresstotheinflammatoryresponse[J].Nature.2008,454(7203):455-62.[3]KawaguchiS,NgDT.Cellbiology.SensingERstress.Science.2011,333(6051):1830-1831.[4]MatusS,GlimcherLH,HetzC.Proteinfoldingstressinneurodegenerativediseases:aglimpseintotheER[J].CurrOpinCellBiol.201123:239–252.[5]MartinSchr?der.TheUnfoldedProteinResponse[J].MolBiotechnol,2006,34(2):279-290.[6]LindholmD,WootzH,KorhonenL.ERstressandneurodegenerativediseases[J].CellDeathDiffer.200613:385–392.[7]ChenG1,GongM,YanM,etal.Sevofluraneinducesendoplasmicreticulumstressmediatedapoptosisinhippocampalneuronsofagingrats[J].PLOSOne.2013,8(2):e57870.[8]CrespoI,San-MiguelB,PrauseC,etal.GlutaminetreatmentattenuatesendoplasmicreticulumstressandapoptosisinTNBS-inducedcolitis[J].PLOSOne.2012,7(11):e50407.29 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中國醫(yī)科大學碩士學位論文致謝時光荏苒，轉(zhuǎn)眼間三年研究生生涯悄然間就接近尾聲了，回想讀研期間的點點滴滴，百感交集。在此謹向所有關(guān)心、支持和幫助我的師長、同學和親友呈上我最衷心的感謝與最美好的祝愿。本論文是在我的導師朱悅教授的悉心指導下完成的。整體課題的設(shè)計和實驗思路都凝聚著老師的精力和心血，尤其是對科研思維的培養(yǎng)為我走向科研道路奠定了堅實的基礎(chǔ)。朱老師淵博的學識、嚴謹?shù)闹螌W作風、新穎的學術(shù)觀點和實事求是的工作作風使我終生受益。您對我的諄諄教導將對我人格塑造產(chǎn)生深遠影響，并將激勵我在今后的學術(shù)道路上不斷進取，在此，對老師精心的培養(yǎng)和辛勤的勞動致以最誠摯的敬意和最衷心的感謝！感謝中國醫(yī)科大學和中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院的全體老師和同學對我學習生活的關(guān)心和幫助，感謝師兄弟陶琳、孟小童、邱水和實驗室同學孫大壯、楊博、許振斌、劉永一、蔡振煜對我學習工作中的指導與幫助，感謝張乃今、田羽、李振航、梁海洋、熊朔、劉強在學習與生活上對我的支持和愛護，感謝周仁義、叢琳、李杰、夏茂盛、梁棟、裴磊等老師給予我在工作上的幫助和關(guān)心，感謝身邊所有的同學和朋友對我的關(guān)心和包容！同時還要對在百忙之中抽出時間評閱論文的專家、學者表示誠摯的謝意！最后，我要感謝一直在身后默默支持和關(guān)心我的家人們，你們對我的支持和關(guān)心是我努力前行的動力和堅強的后盾。趙思超2018年2月33 中國醫(yī)科大學碩士學位論文個人簡歷姓名：趙思超性別：男民族：漢族學習經(jīng)歷：2008年9月—2013年7月中國醫(yī)科大學大學臨床醫(yī)學專業(yè)本科2013年7月—2015年7月遼化總醫(yī)院外科工作2015年9月—2018年7月中國醫(yī)科大學第一臨床學院外科學專業(yè)碩士研究生34
