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《大麥條紋花葉病毒誘導(dǎo)大麥cdna文庫(kù)的構(gòu)建》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、維普資訊http://www.cqvip.com第30卷第4期2008年4月Vo1．30No．4Apr．2008文章編號(hào)：1673—9868f2008)04—0078—04M大麥條紋花葉病毒誘導(dǎo)大麥cDNA文庫(kù)的構(gòu)建西叫南孫現(xiàn)超，薛楊，安德榮。，青玲，楊水英大1．西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶400716；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所，重慶400716；學(xué)U3．西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌712100學(xué)摘要：構(gòu)報(bào)建病毒誘導(dǎo)的寄主植物cDNA文庫(kù)是利用酵母雙雜交方法篩選與病毒相互作用寄主因子的前提條件．該自(文以大
2、麥條紋花葉病毒接種大麥，在ELISA跟蹤檢測(cè)的病毒復(fù)制和運(yùn)動(dòng)初期，采集大麥葉片，用TRIZOL法提取總RNA然，利N用SMART原理進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR獲得dscDNA，SfiI／XhoI共切后1．1瓊脂糖凝膠檢測(cè)并分段回收dscDNA，分別與SfiI／XhoI共切的載體連接后，共同轉(zhuǎn)化Xblue感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建文庫(kù)．文庫(kù)的容量和質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明：文庫(kù)的容量為1．27×1O，插入片段大于500bp，集中在1．2kb左右，符合酵母雙雜交篩選文庫(kù)的要求．鋤關(guān)鍵詞：大麥條紋花葉病毒；誘導(dǎo)；構(gòu)建；cDNA文庫(kù)∞中圖分類號(hào)：E$512
3、．3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A植物病毒侵染植物、在植物體內(nèi)復(fù)制和運(yùn)輸除了需要病毒自身編碼蛋白之間的相互協(xié)助作用外，還需要寄主因子參與j．尋找這些與病毒編碼蛋白相互作用的寄主因子，研究其在植物病毒的生命循環(huán)過(guò)程中所起的作用，是利用基因工程進(jìn)行抗病育種，從而防治植物病毒的另一條有效途徑．6_．其所用的方法主要有Far-western，mRNA差異顯示，基因芯片雜交等，而目前報(bào)道的與TMV、CMV等多數(shù)病毒編碼蛋白相互作用的寄主因子多是用酵母雙雜交系統(tǒng)獲得的．在本文中，我們利用國(guó)內(nèi)分離的BSMV構(gòu)建了病毒誘導(dǎo)大麥葉片的cDNA文庫(kù)，為用
4、酵母雙雜交的方法從中篩選與BSMV編碼蛋白相互作用的寄主因子，尋找來(lái)源于寄主系統(tǒng)的抗病毒靶標(biāo)奠定了基礎(chǔ)．1材料方法1．1毒源和種子大麥條紋花葉病毒于2003年3月采自北京郊區(qū)大麥田，一80℃凍存；接種大麥種子由西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒學(xué)研究室保存．1．2主要試劑RNA提取和純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa(大連寶生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptlI購(gòu)臼Invitrogen公司；LA—Taq酶購(gòu)自Clontech公司；引物由Invitrogen公司合成．1．3大麥的病毒誘導(dǎo)和ELISA檢測(cè)溫室內(nèi)播種大麥，培養(yǎng)
5、至第一葉片10cm左右汁液摩擦接種大麥條紋花葉病毒．接種后每天采集5片葉子進(jìn)行ELISA檢測(cè)病毒，于病毒開(kāi)始復(fù)制和在大麥體內(nèi)運(yùn)輸初期，收集大麥葉片備用．1．4病毒誘導(dǎo)大麥葉片總RNA的提取病毒誘導(dǎo)大麥葉片的總RNA的提取采用北京天根科技生化科技有限公司的RNA提取試劑盒．提取收稿日期：2007—11—12基金項(xiàng)目：重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CSTC．2007BB1349)；西南大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(SWUB2006042)作者簡(jiǎn)介：孫現(xiàn)超(1977一)，男，河南許昌人，博士，副教授，主要從事植物病毒學(xué)及微生物源農(nóng)
6、藥研究．維普資訊http://www.cqvip.com第4期孫現(xiàn)超，等：大麥條紋花葉病毒誘導(dǎo)大麥eDNA文庫(kù)的構(gòu)建79RNA用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，并進(jìn)行瓊脂糖甲醛變性電泳分析．1．5dseDNA的獲得根據(jù)所制備的總RNA濃度，以總RNA(0．5～1g)為模板，用oligo(dT)引物5’。GAGCAACG—CAGAGTACT20—3’，oligo(dG)引物5’一cAAcGcAGAGTAcGcGGG一3’，按BDSMART(tin)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成第一鏈eDNA．取2L第一鏈eDNA，以5GGTGGT
7、GGCCAT壘AACG—CAGAGTACGC_3’(劃線部分酶切位點(diǎn)為Sfi工)為上游引物，5’_ATCGAGCTCGAGCAACGCAGAG—TAD3’(劃線部分酶切位點(diǎn)為Xho工)為下游引物，用長(zhǎng)距離PCR(LA—Taq)合成試劑盒擴(kuò)增得到雙鏈cD—NA，PCR反應(yīng)條件為72℃10rain，95℃1rain；95℃20see，68℃6rain，18個(gè)循環(huán)；4℃保存．取5LRT-PCR產(chǎn)物在1．1瓊脂糖凝膠電泳上鑒定雙鏈eDNA的分布范圍．將PCR產(chǎn)物以Sfi工／Xho工共切，酶切產(chǎn)物用DNA回收試劑盒分5OO～80
8、0bp、8001200bp、12OO～2000bp和大于2000bp共4段回收．、1．6dseDNA與載體的連接和文庫(kù)的轉(zhuǎn)化取2g回收雙鏈eDNA與Sfi工／Xho工共切的pGADT7載體3,ug，于4℃連接24~48h．連接產(chǎn)物經(jīng)無(wú)水乙醇沉淀脫鹽后，分2等份，分別電擊轉(zhuǎn)化人大腸桿菌X—blue感受態(tài)細(xì)胞(Stratagene)，
