SNT2071-2008亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法.pdf

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1、免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)標(biāo)準(zhǔn)最全面中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)犛犖／犜２０７１—２００８亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪狊犻犪狋犻犮狌犿２００８０４２９發(fā)布２００８１１０１實(shí)施中華人民共和國(guó)發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)無(wú)需注冊(cè)即可下載免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)標(biāo)準(zhǔn)最全面中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法ＳＮ／Ｔ２０７１—２００８中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社出版北京復(fù)興門外三里河北街

2、１６號(hào)郵政編碼：１０００４５網(wǎng)址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ電話：６８５２３９４６６８５１７５４８中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社秦皇島印刷廠印刷開(kāi)本８８０×１２３０１／１６印張０．５字?jǐn)?shù)８千字２００８年７月第一版２００８年７月第一次印刷印數(shù)１—２０００書號(hào)：１５５０６６·２１８９４２定價(jià)６．００元免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)無(wú)需注冊(cè)即可下載免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)標(biāo)準(zhǔn)最全面犛犖／犜２０７１—２００８前言本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)福建出入境檢驗(yàn)檢疫局、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科

3、學(xué)院動(dòng)植物檢疫實(shí)驗(yàn)所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：李今中、王念武、周衛(wèi)川、朱水芳、林陽(yáng)武。本標(biāo)準(zhǔn)系首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)無(wú)需注冊(cè)即可下載免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)標(biāo)準(zhǔn)最全面犛犖／犜２０７１—２００８亞洲柑桔黃龍病菌檢疫鑒定方法１范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了進(jìn)出境植物檢疫中亞洲柑桔黃龍病菌的檢疫和鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于進(jìn)出境柑桔種子、苗木等寄主繁殖材料和柑桔水果類等植物產(chǎn)品中亞洲柑桔黃龍病菌的檢疫和鑒定。２原理２．１亞洲柑桔黃龍病菌分類地位亞洲柑桔黃龍病菌（犆犪狀犱犻犱犪狋狌狊犾犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉犪狊犻犪狋犻犮

4、狌犿）屬于薄壁菌門（Ｇｒａｃｉｌｉｃｕｔｅｓ）韌皮部桿菌屬（犔犻犫犲狉狅犫犪犮狋犲狉）亞洲型細(xì)菌。相關(guān)資料參見(jiàn)附錄Ａ。２．２檢疫鑒定原理利用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技術(shù)，進(jìn)行亞洲柑桔黃龍病的檢疫鑒定。ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和ＢＬＡＳＴ，用于區(qū)分亞洲柑桔黃龍病菌和其他兩種柑桔黃龍病菌。３儀器３．１研體。３．２白瓷盤。３．３ｐＨ計(jì)。３．４ＰＣＲ管、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管（１．５ｍＬ）。３．５移液槍（１０００μＬ可調(diào)、２００μＬ可調(diào)、２０μＬ可調(diào)、２．５μＬ可調(diào)）。３．６恒溫水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱。３．７分析電子天平。３．８低溫冷凍超速離

5、心機(jī)、低速離心機(jī)。３．９ＰＣＲ擴(kuò)增儀。３．１０電泳儀。３．１１凝膠成像儀。３．１２低溫冰箱。３．１３高壓滅菌鍋。３．１４超凈工作臺(tái)。４試劑藥品４．１５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴｒｉｓＨＣｌ。４．２１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。４．３０．２ｍｏｌ／Ｌ氫氧化鈉＋１％ＳＤＳ。４．４０．５ｍＬ的乙酸鈉（ｐＨ４．８）。４．５液氮。４．６無(wú)水乙醇、雙蒸水（ＤＤＷ）。４．７引物。４．８１０×ＰＣＲ緩沖液、犜犪狇多聚酶。１免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)無(wú)需注冊(cè)即可下載免費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)(www.freebz.net)標(biāo)準(zhǔn)最全面犛犖／犜２０７１—２００８４．９ｄＮＴＰ、Ｍ

6、ａｒｋｅｒ。４．１０１．２％瓊脂凝膠、ＥＢ。４．１１ＤＮＡ純化試劑盒。５亞洲柑桔黃龍?。脿釥顮錉闋錉釥魻鯛鬆鞝闋鉅鍫驙餇鉅釥銧魻鍫驙釥鬆闋釥魻闋銧鯛恚┑臋z測(cè)和鑒定５．１檢驗(yàn)樣品的準(zhǔn)備癥狀檢查：癥狀復(fù)雜，易與生理病害混淆，其典型癥狀為黃梢和斑駁。發(fā)病初期，病樹(shù)部分新梢葉片不轉(zhuǎn)綠而呈均勻黃化；葉片從主、側(cè)脈附近或葉片基部邊緣出現(xiàn)黃綠相同的斑駁，后期葉片均勻黃化、失去光澤，葉脈柄腫大，木栓化，硬脆而易脫落；果實(shí)小而呈畸形。檢測(cè)樣品：從待檢樣品中挑取有疑似癥狀的柑桔葉片葉脈約０．０５ｇ～０．１ｇ，用無(wú)菌水沖洗凈。陽(yáng)性對(duì)照：取感病的柑桔葉脈０．０５ｇ～０．１ｇ，用無(wú)菌水

7、沖洗凈。陰性對(duì)照：取健康的柑桔葉脈０．０５ｇ～０．１ｇ，用無(wú)菌水沖洗凈。５．２樣品犇犖犃提取將準(zhǔn)備好的樣品和陽(yáng)性對(duì)照樣品各０．０５ｇ～０．１ｇ，剪碎后分置于研缽內(nèi)，加液氮研磨成粉末，再加入５０ｍｍｏｌ／Ｌ的ＴｒｉｓＨＣｌ，１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）各０．４ｍＬ，１４０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，取上清液０．５ｍＬ，加入等體積０．２ｍｏｌ／Ｌ的氫氧化鈉＋１％ＳＤＳ，搖勻，冰?。保埃恚椋?，再加入０．５ｍＬ的乙酸鈉（ｐＨ４．８），搖勻，冰?。担恚椋睿保矗埃埃埃颍恚椋铍x心５ｍｉｎ，取上清液０．５ｍＬ，加入１ｍＬ的無(wú)水乙醇，在－２０℃下放置２ｈ，１５００

8、０ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉ