椎間盤退變higfi基因治療的實驗研究

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1、中山大學博士學位論文椎間盤退變hIGF-I基因治療的實驗研究姓名：黃宗強申請學位級別：博士專業(yè)：骨科學指導教師：劉尚禮20040423中山大學博士學位論文椎問盤退變hIGF．1摹兇治療的實驗研究椎問盤退變hlGF．I基因治療的實驗研究專業(yè)：骨科學博士生：黃宗強導師：劉尚禮教授中文摘要下腰痛(10wbackpain，LBP)是脊柱外科的常見病、多發(fā)病。資料表明：美國人一生中發(fā)生下腰疼的概率為60％～80％，在成人喪失勞動能力的原因中，下腰痛位居第三位。椎間盤退變(intervertebraldiskdegeneration，IVDD)為LBP的主

2、要病因。現今臨床上對于IVDD引起的LBP多先采用保守治療，對于通過正規(guī)保守治療癥狀不能緩解的患者，采用手術治療。應用最廣泛的手術是椎間盤切除或／和脊柱融合術，可經各種手術入路(前路、后路、側方入路及聯(lián)合手術入路)及使用多種方法(自體骨、異體骨移植術、各種Cage和多種內固定器械的應用)手術治療。近年來，這兩類手術技術取得了長足的進步，微創(chuàng)外科技術的應用使創(chuàng)傷越來越小且確實、有效地緩解了癥狀。但是，減壓術后必然導致椎間關節(jié)結構、形態(tài)、功能異常和不穩(wěn)定，融合術后亦加速鄰近節(jié)段的退變，遠期優(yōu)良率在70％左右，療效并不理想。原因在于減壓和融合的治療方

3、法不能恢復和保持椎間關節(jié)的正常結構與生理功能，不能減緩IVDD的進程。它們是一種IVDD發(fā)展到后期引起嚴重LBP的對證治療方法。為了尋找一種IVDD的理想治療方法，近年來，學者們提出了椎間關節(jié)成形術。椎間關節(jié)成形術包括椎間盤置換術和椎間盤再生。椎間盤置換術已進入臨床試用階段，近期效果尚可，遠期效果尚需要進一步隨訪。采用導入生長因子基因和／或炎癥因子拮抗劑基因逆轉或延緩IVDD的椎間盤再生成為近年實驗研究的熱點。人胰島素樣生長因子(humaninsulin-likegrowthfactor，hlGF．I)是一種由70個氨基酸組成的多肽，Mr=7．

4、6×103，其結構與胰島素同源，受生長激素調節(jié)。文獻報道hlGF-I生長因子在椎間盤中的作用有：①促進聚集蛋白多糖(aggrecan)合成，減慢aggrecan的降解，抑制基質金屬蛋白酶表達。②逆轉體外培養(yǎng)的椎間盤細胞調亡。③促進合成u型膠原蛋白。榷間盤退變hlGF．I基因治療的實驗研究囂師：劉尚扎教授撼士生；裝宗強探討hlGF-I基因是否S％逆轉絨延緩IVDD，本硬究制作撅題蘭大巍兔IVDD攘型，梅建攜帶MGF-I舀酌基函的朦病毒載體(AdlCMV-hlGF-1)，體矯襝溯箕生物學活性，體內轉染IVDD退變的椎間盤細胞進行hlGF-1基因治療

5、。第一部分IVDD動物模黧的建立耳的；鍘{乍腰雄失璁誘發(fā)的WDD動甥模型，為IVDD蠡冬hlGF-1基閡治療的羹定萋稿。方法：48靈新西蘭大自兔，雄往。分剮做骨性手術、軟組織手術。骨性手術切除L4、L5的下關節(jié)突，保留L5、L6的上關節(jié)突，L4／5、L5／6援閾擻必實驗縫挫闥盤，媯愆、L6／7椎闕盤淹垂巍對照綴榷闋盤。軟組纜手術僅剝離L4～L6稚旁肌肉，L4，5、L5／6稚問盤為實驗對照組椎間盤。術后1、2、4及8m，進行組織學、分予生物學檢測觀察椎間擻的變化。①組織學觀察：取掛，行雄閾盤題狀位、矢狀位及橫斷位切片，HE、Masson三色進行光

6、學晨徽鏡觀察。稚聞盍橫斷面上膠原纖維、aggrecan的排列改交采用掃描電子顯微鏡觀察；透射電予顯微鏡觀察椎間盤中細胞、細胞器及細胞釙基質的變化。②分子生物學檢測：取材，攫取等矮量椎闋盤標本瓣總RNA。采爝Prime5．0軟件設計aggrecan、II登膠原及I疆膠原的引物。采用RT-PCR方法分別擴增三種目的綦因片段。用磷酸甘油醚脫氫酶(glyeeraldehydephosphatedehydrogenase，GAPDH)做為海參照分裂進行三穗基辮mRNA袈達半定量。實驗數據蠲SPSS11．5軟件包統(tǒng)計。緒采：術后2只死于髭部壞瘋。①組織學梭

7、查：正常新西蘭大自兔椎間盤膠原纖維相互編織平行排夢4，椎間盤細胞均勻蠢序地刳}列于膠器紓維之閩，呈圖形或橢圓形。隧著術惑時闖延長，實驗組椎閶盤逐漸出現髓核皺縮、裂變，酸性粘多糖減少，纖維環(huán)膠原變性、破裂。稚間盤細胞形狀不規(guī)則，數量減少，線粒體、粗碰慮質劂腫脹，核濃續(xù)，核朕皺續(xù)。術屠8m，部分檻闥盤出現髓核綴織突入纖維環(huán)。②分子生物學檢測：aggrecan、II麓膠原基閔片段凝膠電泳出現在200～300bp處；I型膠原出現在100～200bp處：GAPDH出現在500～600bp處，位置與理論僮斃全相同。在提固縫別內睫著拳蜃時闥怒長，aggree

8、an、娃型膠添mRNA的稻對表達量下降；褶簡時期內，實驗對照組最高，實驗組最低。具有統(tǒng)計學意義(P