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《羊軟骨ⅱ型膠原蛋白的提取純化與鑒定》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)·730·寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)JoumalofNingxiaMedicalUniversity第31卷6期2009年12月文章編號(hào)：1674—6309(2009)06—0730—02羊軟骨Ⅱ型膠原蛋白的提取純化與鑒定·論著·肖旭1，石文達(dá)2，姚青1，陳虎1，王基云1，李曉兵1，高嶺1(1．寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川750004；2．承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，承德067000)摘要：日曲從羊肋軟骨中提取純化Ⅱ型膠原蛋白，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。方法選擇羊肋軟骨為原料經(jīng)脫脂、脫鈣后，用鹽酸胍去除蛋白多糖，經(jīng)胃蛋白酶消化、氯
2、化鈉鹽析等步驟，提取純化蛋白，然后進(jìn)行鑒定。結(jié)摹4moVL鹽酸胍能有效去除蛋白多糖，用胃蛋白酶的限制性酶解結(jié)果滿(mǎn)意；氯化鈉鹽析濃度為3moVL時(shí)最佳。SDS—PAGE電泳結(jié)果顯示提取純化的蛋白與Sigma公司的Ⅱ型膠原蛋白一致。Ⅱ型膠原蛋自最大吸收峰為212nln。結(jié)論從羊肋軟骨提取的Ⅱ型膠原蛋白純度高，且符合Il型膠原蛋白的特征。關(guān)鍵詞：Ⅱ型膠原蛋白；軟骨；蛋白多糖中圖分類(lèi)號(hào)：Q51文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AⅡ型膠原蛋白(collagentypeII，C1I)是軟骨基質(zhì)的主要有機(jī)成分，是關(guān)節(jié)軟骨中主要的細(xì)胞外間
3、質(zhì)之一。近年來(lái)研究表明，類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與ClI自身免疫反應(yīng)有關(guān)【“引，口服cⅡ誘導(dǎo)免疫耐受對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RheumatoidArthritis，RA)有顯著的療效[4]。對(duì)于膠原蛋白的提取目前所報(bào)道的方法，操作復(fù)雜，條件不一。結(jié)果存在很大的差別拍。8】。本研究選擇寧夏富有的綿羯羊肋軟骨為原料，來(lái)制備較高純度的Ⅱ型膠原，報(bào)告如下。1實(shí)驗(yàn)材料和方法1．1主要試劑和耗材胃蛋白酶(Amr；e∞o公司)；鹽酸胍(Amresco公司)；牛Ⅱ型膠原蛋白參照品(C7806Sigma公司)；46—200kD蛋
4、白質(zhì)分子量標(biāo)志物(寶生物工程有限公司)，陰離子交換載體(DEAE32上海試劑二廠(chǎng))，透析袋(德國(guó)SercaFeinbiochemica公司)，余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1．2主要儀器電泳儀(Bio—Pad公司)；凝膠全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Bio—Ra公司)；冷凍離心機(jī)(日立公司CFl6R)【)；酸度計(jì)(梅特勒一托利多儀器有限公司)；電子天平(梅特勒一托利多儀器有限公司)；721分光光度計(jì)(Varian公司)；LL一3000型冷凍干燥機(jī)(ThermoElectronCorporation)。1．3方法1．3．
5、1膠原蛋白的提取從新鮮的羊肋軟骨中切取透明軟骨，剝?nèi)ス悄?，去除骨化部分，用生理鹽水洗凈，切成0．收稿日期：2009一∞一14基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)教育廳資助項(xiàng)目(200749)；寧夏回族自治區(qū)科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(2009年)作者簡(jiǎn)介：肖旭(1982一)，男，河北人，在讀碩士研究生，從事生化藥理學(xué)研究工作。通信作者：高嶺(1958一)。女，研究員，碩士生導(dǎo)師，從事生化藥理學(xué)研究工作。E—mail：一@nxmu．edu．crl5mm左右的薄片，液氮冷凍粉碎后稱(chēng)重，按照軟骨量加入5倍體積的脫脂液(氯仿：甲醇
6、：水=l：2：0．8)在4℃下攪拌脫脂48h，期間每8h更換脫脂液直到脫脂完全，在同樣溫度和攪拌條件下用lO倍體積的0．ImoVL鹽酸進(jìn)行脫鈣處理48h，直到軟骨變?nèi)彳?，離心去除脫鈣液，按照每克軟骨加入10倍體積的4mol／L鹽酸胍，于4℃攪拌48h，120009離心20min，沉淀用Tris—HCl(pH7．4)緩沖液和0．5moL／L乙酸充分洗滌后，用5倍體積的胃蛋白酶消化液(0．5moL／L乙酸配成19／L)混懸，4℃下攪拌24h，120009離心30rain，收集上清液；沉淀再加5倍體積的胃蛋
7、白酶消化液重復(fù)酶解一次，離心收集上清液?；旌蟽纱紊锨逡海?mol／LNaOH迅速調(diào)節(jié)上清液至pH7．4。加入氯化鈉(NaCI)使其濃度為3mol／L，40C鹽析過(guò)夜，離心得到上清液和沉淀Al。調(diào)NaCI濃度至4moVL時(shí)．40C鹽析過(guò)夜，離心得到上清液和沉淀A2。取沉淀Al用0．1moL／L乙酸溶解。2moL／LNaOH中和至pH7．4，分別再用0．05moL／LTris—HCI(pH7．4)、蒸餾水進(jìn)行透析平衡后，即得膠原初提液sl。1．3．2陰離子交換樹(shù)脂(DEAE32)的預(yù)處理DEAE一32經(jīng)
8、過(guò)溶脹、酸處理、堿處理后，用去離子水平衡至中性，處理好的離子交換載體置于4℃冰箱冷卻備用。1．3．3蛋白批量離子交換將蛋白初提液s1和3倍體積的％s—HCI(pH7．4)緩沖液混合后，置于燒杯中，加入適量用緩沖溶液平衡后的陰離子交換載體，使樹(shù)脂和蛋白溶液的體積比約為l：5，混合均勻，緩慢攪拌120rain后，120009離心，收集上清液。于上清液中加入氯化鈉使其濃度為3moVL，4℃鹽析過(guò)夜，120009離心30min，收集沉淀。將沉淀用0．1moVL乙
