豬細(xì)小病毒ppvsd1株vp2基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

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1、萬方數(shù)據(jù)第39卷第8期2008年8月東北農(nóng)業(yè)大．學(xué)學(xué)報(bào)JournalofN砷∞mA#culturalUniversity39(8)：100-103Aug．2008文章編號(hào)1005—9369(2008)08-0100-04豬細(xì)小病毒PPV—SDI株VP2基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建王金良，沈志強(qiáng)‘，管宇，曲光剛，唐娜(山東省濱州畜牧■醫(yī)研究院。山東省畜禽用蜂膠疫苗工程技術(shù)研究中心，山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600)摘要：通過細(xì)酋內(nèi)同源重組的方法成功構(gòu)建了含有豬細(xì)小病毒(PlⅣ)¨哩基因的重組腺病毒表達(dá)栽體。將y忍基因亞克隆連接到腺病毒穿梭載體pS

2、hutth—CMV上，并將重組質(zhì)粒pShutde-CMV／VP2用PineI線性化后轉(zhuǎn)化至攜帶有腺病毒骨榘栽體pAOF螂一1的大腸桿茵B(yǎng)J5183感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)茵內(nèi)同源重組產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒pAaV鄴,一VP2。為進(jìn)一步研究PPV腺病毒活栽體疫苗奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬細(xì)小病毒；VP2基因；重組腺病毒中圖分類號(hào)：鼴船；$852．65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A豬細(xì)小病毒(PorcineParvovirus，PPV)屬細(xì)小病毒科，可引起豬的繁殖障礙病，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國80年代中后期頻繁從國外引種，使該病在我國迅速傳播。近幾年對(duì)我國規(guī)?；B(yǎng)豬場造成的

3、危害尤為嚴(yán)重，同其它許多病毒病的防治一樣，該病也主要以免疫預(yù)防為主【11。目前已有10多個(gè)國家研制出了PPV疫苗，包括弱毒疫苗與滅活疫苗。盡管PPV的弱毒苗和滅活疫苗在豬細(xì)小病毒病的預(yù)防控制中起到了十分重要的作用，但是各種疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗發(fā)生重組與毒力返強(qiáng)及圓環(huán)病毒污染的潛在威脅，滅活疫苗生產(chǎn)細(xì)胞不穩(wěn)定、生產(chǎn)困難、生產(chǎn)成本高等【2】。因此尋找更為安全有效的疫苗一直是豬細(xì)小病毒免疫預(yù)防研究的主題。現(xiàn)有研究表明，以腺病毒為表達(dá)載體的基因工程疫苗具有良好的應(yīng)用前景，該載體介導(dǎo)的基因具有轉(zhuǎn)移效率高、感染細(xì)胞譜廣、病毒滴度高、易于濃縮和貯存等諸

4、多優(yōu)點(diǎn)【31?！驹囼?yàn)構(gòu)建了包含PPVVP2基因的腺病毒質(zhì)粒，為成功研制安全有效的PPV腺病毒活載體疫苗奠定了基礎(chǔ)。收稿日期：2008-02—18基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2005D10)作者簡介：王金良(t97s-)，男，黑龍江人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事動(dòng)物分子病毒學(xué)與免疫學(xué)研究工作。+通訊作者E-mail：bzshenzq@sina．coin1材料與方法I．I質(zhì)粒及菌株腺病毒穿梭載體pShuttle—CMV、腺病毒骨架．載體'pAclEasy一1、DH5a、BJ5183、及攜帶有PPV、y挖基因的重組質(zhì)粒pcDNA3．1(+)一VP2由本實(shí)

5、驗(yàn)室保存并提供。’1．2工具酶及其它試劑盒。T4DNA連接酶、KpnI、XbaI、砌酶、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自大連寶生物公司。PmeI、PacI等限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。1．3鑒定引物鑒定引物為構(gòu)建pcDNA3．1(+)一VP2重組質(zhì)粒時(shí)設(shè)計(jì)的，由上海生物工程有限公司合成。引物序列為：iP1：5’-ACAg叢!盟ACCGCAATGGGTGAAAA一3’(含BarnHI酶切位點(diǎn))iP2：5’一AAGCGGCCGCAGTI’丌：-I'AT兀'ACAGAGT-3’(含NotI酶切位點(diǎn))’1．4目的基因獲得用KpnI、XbaI限制性內(nèi)切酶雙

6、切攜帶有PPVVP2基因的重組質(zhì)粒pcDNA3．1(+)-VP2，回收1．8kb的目的片段。1．5重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建將回收得到的VP2基因與同時(shí)用勛nI、XbaI萬方數(shù)據(jù)第8期王金良等：豬細(xì)小病毒PPV-SDI株VP2基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建·101·限制性內(nèi)切酶雙切的腺病毒pShuttle-CMV載體用3"4DNA連接酶進(jìn)行連接。按常規(guī)方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5tx感受態(tài)細(xì)胞中，在含卡那抗性的瓊脂平板上篩選，進(jìn)行克隆，提取質(zhì)粒。采用酶切、PCR等方法進(jìn)行鑒定，得到陽性重組質(zhì)粒，命名為pShume—CM、WP2。1．6重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建用骨架載體p

7、AdEasy一1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183，制備攜帶腺病毒骨架載體的感受態(tài)菌。將重組穿梭載pShuttle—CMV／VP2用PineI內(nèi)切酶線性化，轉(zhuǎn)化至含攜帶腺病毒骨架載體的感受態(tài)菌BJ5183。取適量的細(xì)胞涂入含50nag·mL_卡那霉素的培養(yǎng)皿中，于37℃培養(yǎng)16～20h，挑選卡那抗性克隆，小量提取質(zhì)粒DNA，用0．8％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳遷移率分析及PacI酶切圖譜分析。將所得的重組腺病毒質(zhì)粒以上述同樣條件電轉(zhuǎn)入宿主菌DH5n,，在此宿主菌內(nèi)可獲得大量高質(zhì)量的質(zhì)粒，挑選目的克隆，命名為pAdEasy—VP2。2結(jié)果與分析2．1VP2基因的獲得酶切產(chǎn)物經(jīng)1

8、％瓊脂糖凝膠電泳分析表明，切出了與y挖基因相應(yīng)的約1