分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)

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1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)知識(shí)分子生物學(xué)是在生物化學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以研究核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能等生命本質(zhì)的學(xué)科，在核酸、蛋白質(zhì)分子水平研究發(fā)病、診斷、治療和預(yù)后的機(jī)制。其中基因工程（基因技術(shù)，基因重組）是目前分子生物學(xué)研究熱點(diǎn)，這些技術(shù)可以改造或擴(kuò)增基因和基因產(chǎn)物，使微量的研究對(duì)象達(dá)到分析水平，是研究基因調(diào)控和表達(dá)的方法，也是分子水平研究疾病發(fā)生機(jī)制、基因診斷和基因治療的方法。轉(zhuǎn)化（transformation）、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段?；蛑亟M的目的之一是基因克

2、?。╣eneclone），基因克隆可理解為以一分子基因?yàn)槟０鍞U(kuò)增得到的與模板分子結(jié)構(gòu)完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析?！　⊥鈦砘蛞鸺?xì)胞生物性狀改變的過程叫轉(zhuǎn)化（transformation），以噬菌體把外源基因?qū)爰?xì)菌的過程叫轉(zhuǎn)染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質(zhì)從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。一個(gè)或一組基因從一處轉(zhuǎn)移到基因組另一處的過程叫轉(zhuǎn)位（transposition），這些游動(dòng)的基因叫轉(zhuǎn)位子

3、?！　∫?、基因工程的常用工具　　（一）載體　　載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之傳代、擴(kuò)增、表達(dá)的工具。載體有質(zhì)粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質(zhì)粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復(fù)制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標(biāo)記；有供外源DNA插入的位點(diǎn)；本身體積小等特征。　　質(zhì)粒存在于多種細(xì)菌，是染色體（核）以外的獨(dú)立遺傳因子，由雙鏈環(huán)狀DNA組成，幾乎完全裸露，很少有蛋白質(zhì)結(jié)合。質(zhì)粒有嚴(yán)緊型和松弛型之分。嚴(yán)緊型由DNA多聚酶Ⅲ復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制1-5個(gè)質(zhì)粒。而

4、松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復(fù)制，一個(gè)細(xì)胞可復(fù)制30-50個(gè)質(zhì)粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質(zhì)合成，使質(zhì)粒有效利用原料，復(fù)制更多的質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質(zhì)粒都含有多個(gè)基本基因，如復(fù)制起動(dòng)區(qū)（復(fù)制原點(diǎn)Ori），便于復(fù)制擴(kuò)增；抗抗生素標(biāo)記（抗氨芐青霉素Apr、抗四環(huán)素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coliLacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發(fā)動(dòng)子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉(zhuǎn)錄終止序列，便于插入的外源基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)。質(zhì)粒上還有許多限制性內(nèi)切酶的

5、切點(diǎn)，即基因插入位點(diǎn)，又叫基因重組位點(diǎn)，基因克隆位點(diǎn)?！　〕Ｓ檬删w載體有單鏈?zhǔn)删wM13系統(tǒng)；雙鏈?zhǔn)删w系統(tǒng)。噬菌體應(yīng)和相應(yīng)的宿主細(xì)胞配合使用。以上載體各有特點(diǎn)，便于選擇，靈活應(yīng)用?！　。ǘ┕ぞ呙浮　」ぞ呙甘腔蛑亟M技術(shù)不可缺少的工具。主要有限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核酸酶等?！　∠拗菩詢?nèi)切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶之分，Ⅱ型能嚴(yán)格識(shí)別核酸序列，并在識(shí)別區(qū)內(nèi)特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內(nèi)切酶。識(shí)別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉(zhuǎn)對(duì)稱。切口分開端和粘端，

6、產(chǎn)生3′－OH和5′－P末端。內(nèi)切酶品種多，使用時(shí)應(yīng)注意溫度、緩沖液用量（一般1μgDNA/2-5單位酶）等反應(yīng)條件。酶識(shí)別序列切口?AluⅠ…AGCT……AGCT…四核苷酸?…TCGA……TCGA…平端切口EcoR1…GAATTC……GAATTC…六核苷酸?…CTTAAG……CTTAAG…粘端切口　　連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應(yīng)需有Mg2+和ATP存在，pH7.5-7.6。最適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考

7、慮到被連接DNa的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右?！　【酆厦赣蠨NA聚合酶（以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow大片段），T4或T7噬菌體DNA聚合酶等）；RNA聚合酶（以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶）；逆轉(zhuǎn)錄酶（以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現(xiàn)外，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和TaqDNA聚合酶都有逆轉(zhuǎn)錄活性）。　　大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→

8、3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產(chǎn)生的一個(gè)大片段，有5′→3′聚合酶和5′→3′外切酶活性，無3′→5′外切酶活性。可用于缺口翻譯（Nicktranslation）法標(biāo)記核酸，也可用于DNA序列測定，修補(bǔ)DNA鏈等?！　『怂崦赣蠨Nase、RNase、核酸酶S1等，可水解相應(yīng)的DNA和RNA，核酸酶S1可降解單鏈DNA和RNA，用量增大也可降