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《分子生物學(xué)實驗-實驗操作》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、重組人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的構(gòu)建分子生物學(xué)實驗-實驗操作基因、載體、受體菌株基因載體菌株質(zhì)粒酶切連接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提取PCR實驗技術(shù)要求應(yīng)掌握的實驗技術(shù)酶切,連接凝膠回收制備感受態(tài)細胞質(zhì)粒提取PCR瓊脂糖凝膠電泳考察指標(biāo)電泳電泳感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化率電泳電泳電泳實驗流程:第一天rhIL-18基因的PCR產(chǎn)物質(zhì)粒pUC18BglⅡ和PstⅠ雙酶切BamHⅠ和PstⅠ雙酶切濃度1%瓊脂糖凝膠電泳凝膠回收配制LB液體與固體平板培養(yǎng)基滅菌實驗流程:第二天凝膠回收與溶液回收電泳檢驗T4連接酶連接過夜E.coliDH5α菌株37℃過夜
2、培養(yǎng)實驗流程:第三天提取質(zhì)粒DNA濃度1%瓊脂糖凝膠電泳實驗流程:第四天PCR濃度1%瓊脂糖凝膠電泳雙酶切反應(yīng)（20μL體系）rhIL-18的PCR產(chǎn)物PCR產(chǎn)物10μLBufferO2μL無菌水7μLBglⅡ0.5μLPstⅠ0.5μL質(zhì)粒pUC18質(zhì)粒10μLBamHⅠBuffer2μL無菌水6.7μLBamHⅠ0.3μLPstⅠ1μL37℃酶切反應(yīng)3小時。Hybridsite培養(yǎng)基配制LB液體培養(yǎng)基每1L配量：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化鈉5g調(diào)節(jié)pH到7.0LB固體培養(yǎng)基:每100ml液體培養(yǎng)基添加1.5g瓊脂每組準(zhǔn)備：
3、1個30ml液體培養(yǎng)基滅菌1個30mlLB液體培養(yǎng)基微量移液器槍頭（200uL）瓊脂糖電泳瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。DNA的分子大小瓊脂糖濃度DNA分子的構(gòu)象電源電壓嵌入染料的存在離子強度影響瓊脂糖凝膠回收瓊脂糖凝膠電泳檢驗，回收酶切產(chǎn)物：使用UNIQ-10柱式凝膠回收試劑盒分別對：目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收載體片段（2.7Kb片段）進行凝膠回收1.通過瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其他片段盡可能分開，然后用干凈的手術(shù)刀切下含需回收DNA的瓊脂塊，放入Ep管。2.按300μL/100mg（3
4、:1）的比例加入BindingBufferⅡ，置于50-60℃水浴中10min，使凝膠徹底融化。期間，每2min混勻一次。3.將融化的溶膠液轉(zhuǎn)移到套在2-ml收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置2min。12000rpm室溫離心1min。4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，加入500μLWashSolution，12000rpm室溫離心1min。5.重復(fù)步驟4一次。瓊脂糖凝膠回收6.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中，12000rpm室溫離
5、心2min。7.將UNIQ-10柱放入一根新的Ep管中，在柱子膜中央加30μLElutionBuffer，60℃放置5min。8.12000rpm室溫離心1min，離心管中的液體即為回收的DNA片段。從溶液中回收DNA：根據(jù)溶液的體積，加入3倍體積的BindingBufferⅡ混勻。以下操作參照瓊脂糖凝膠中回收DNA步驟3-8.計算基因與載體片段比例紫外下觀察基因與載體片段的亮度基因的摩爾數(shù)≈基因片段亮度/堿基數(shù)（495bp）載體的摩爾數(shù)≈載體片段亮度/堿基數(shù)（2700bp）基因摩爾數(shù)/載體摩爾數(shù)最佳比例是3：1連接反應(yīng)⑴在滅菌的
6、0.2mL離心管（PCR管）中進行 ⑵20μL體積反應(yīng)體系中：10×快速連接緩沖液2μLrhIL-18雙酶切產(chǎn)物XμL質(zhì)粒pUC18雙酶切產(chǎn)物YμLT4-DNA連接酶1μL20℃1h，4℃過夜感受態(tài)菌的制備（1）E.coliDH5α菌株37℃過夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過夜培養(yǎng)的菌液0.3mL加入到30mLLB培養(yǎng)基中，37℃，230r/min振蕩培養(yǎng)3h，至OD600約為0.4左右。（2）無菌條件下，將50mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置10min，使培養(yǎng)物冷卻至0℃。（3）在預(yù)冷4℃的離心機上以4000r/min離心10min，棄去
7、上清，加入30mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10min。（4）以4000r/min在4℃離心10min，棄去上清，每30mL初始培養(yǎng)物用1.0mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細胞沉淀，200μL/管分裝。pUC18-hIL-18重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）向分裝有200μLE.coliDH5α菌株感受態(tài)細胞的EP管中加入10μL的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30min。（2）將該EP管放入預(yù)加溫至42℃的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細胞冷卻1~2min。（3
8、）向EP管加入800μLLB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37℃搖床上，150r/min，溫育45min以復(fù)蘇菌株。（4）將200μL上述培養(yǎng)物加到含100μg/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細胞平鋪于瓊脂平板表面。（5）將平板置于室溫下至液
