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《實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作規(guī)范及注意事項(xiàng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作規(guī)范及注意事項(xiàng)一、酶與載體的分裝酶類與載體：T載體(50ng/μl)用滅菌水稀釋4倍（12.5ng/μl）后分裝成10μl或20μl；連接酶（solutionΙ）按5μl分裝；dNTP（10mM）分裝成50μl；無菌水分裝成1ml；注意：（1）所有分裝都必須用已滅菌的管。（2）所有工具酶和載體的使用過程均在冰浴中進(jìn)行。（3）工具酶、載體以及試劑盒等實(shí)驗(yàn)室共用物品，用完后必須及時(shí)放回原處，以免耽誤他人使用。（4）當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管（盒）公用物品時(shí)，請(qǐng)馬上告知負(fù)責(zé)人購買，以免耽誤使
2、用。（5）感受態(tài)，氨芐青霉素和IPTG由研究生輪流負(fù)責(zé)制備。每人負(fù)責(zé)六個(gè)月。其他試劑則由第一位使用新包裝的同學(xué)分裝。由于分子實(shí)驗(yàn)工具酶比較容易失活，必須在冰上進(jìn)行分裝。二、常見抗生素及IPTG的配置以氨芐青霉素為例：1．準(zhǔn)備足夠量的1.5ml的EP管、兩個(gè)100ml的離心管、0.22μm水系濾器、注射器、蒸餾水，以上用品均要進(jìn)行高壓滅菌。2.潔凈工作臺(tái)紫外滅菌，然后進(jìn)行以下操作。3．稱取2g的氨芐青霉素粉末于離心管中，加入滅菌水至總體積為20ml，輕搖離心管，至氨芐青霉素粉末完全溶解，以免過濾時(shí)堵塞濾膜。4．用注
3、射器吸取配制好的溶液，然后把濾器安在注射器上，緩緩?fù)苿?dòng)注射器活塞，把溶液經(jīng)濾膜推至100ml的離心管中。注意：動(dòng)作要緩和，使濾出液出口正對(duì)著離心管，還要防止染菌。5．把100ml離心管中已除菌的氨芐青霉素溶液分裝到1.5ml的EP管中，每管0.5ml。在EP管上做好標(biāo)記，包括名稱、濃度、日期等。6．把做好標(biāo)記的盛有氨芐青霉素的EP管于-20℃保存。注意：當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管抗生素時(shí)，請(qǐng)馬上告知有關(guān)人員及時(shí)配制，以免耽誤使用。表1.常見抗生素的儲(chǔ)存濃度及工作濃度名稱儲(chǔ)存濃度工作濃度氨芐青霉素（ampicill
4、in）100mg/ml50μg/ml～100μg/ml卡那霉素（kanamycin）10mg/ml10μg/ml～50μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25mg/ml12.5μg/ml～25μg/ml鏈霉素（streptomycin）50mg/ml10μg/ml～50μg/ml四環(huán)素（tetracyyline）10mg/ml10μg/ml～50μg/mlIPTG1M0.05-0.6mM三、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制參見《分子克隆》。四、總DNA的提取具
5、體步驟參考試劑盒說明書。注意：革蘭氏陽性菌DNA提取時(shí)需要加溶菌酶。五、基因擴(kuò)增1．引物與合成：設(shè)計(jì)引物序列，發(fā)至生工公司進(jìn)行合成（jinan@sangon.com）。2．引物配制：合成后的引物先離心至管底，然后按說明書用無菌水稀釋至10-50μM，分裝至無菌EP管中，做好標(biāo)記（一定要標(biāo)記濃度?。┖?，于-20度保存?zhèn)溆谩?．PCR反應(yīng)體系配制：將所需各組分在冰浴中化開后，進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配制。反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)按不同聚合酶的說明書進(jìn)行，以transgen的easyTaq酶擴(kuò)增1kb基因序列為例，100μl反應(yīng)體
6、系為：10×buffer10μl，dNTP(10mM)2μl,引物各2μl（10-50μM），模板1μl（根據(jù)濃度加減體積），Taq酶1μl，ddH2O82μl（注意：加入順序?yàn)椋核?，buffer，dNTP，引物，模板，酶）。渦旋混勻，分裝至四-五管，瞬時(shí)離心。注意：若反應(yīng)時(shí)間較長在反應(yīng)混合液的上層加10-20μl的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)。4．將管放入PCR儀中，在PCR儀上設(shè)置好PCR反應(yīng)參數(shù)，例如：94℃5min，94℃40sec，Tm55℃1min，72℃2min，72℃10min，16℃1h,
7、一般設(shè)30個(gè)循環(huán)。待溫度降至16℃后停止PCR儀，盡快取出樣品，不允許過夜。六、瓊脂糖核酸電泳1.電泳緩沖液的配制：電泳緩沖液一般為TAE（或TBE）,其配制方法參見表2，先配制50×母液放于4度冰箱中，電泳時(shí)稀釋100倍使用。2.將制膠模具和梳子沖洗干凈，架好梳子；3.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠（表3）：準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液；4．放入到微波爐內(nèi)加熱至膠粒全部熔化(一般沸三次即好),冷卻片刻，倒入制膠模具中，待其凝固；a)室溫下30-4
8、5分鐘后凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；b)向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1mm為宜，如樣品孔內(nèi)有氣泡，應(yīng)設(shè)法除去；c)在DNA樣品中加入1/5-1/10體積的上樣緩沖液（1%SDS,50%甘油,0.05%溴酚藍(lán)），混勻后，用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi)；5．接通電源，紅色為正極，黑色為負(fù)極，切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加
