資源描述:
《實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作規(guī)范及注意事項(xiàng)》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本操作規(guī)范及注意事項(xiàng)一、酶與載體的分裝酶類與載體:T載體(50ng/μl)用滅菌水稀釋4倍(12.5ng/μl)后分裝成10μl或20μl;連接酶(solutionΙ)按5μl分裝;dNTP(10mM)分裝成50μl;無菌水分裝成1ml;注意:(1)所有分裝都必須用已滅菌的管。(2)所有工具酶和載體的使用過程均在冰浴中進(jìn)行。(3)工具酶、載體以及試劑盒等實(shí)驗(yàn)室共用物品,用完后必須及時(shí)放回原處,以免耽誤他人使用。(4)當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管(盒)公用物品時(shí),請(qǐng)馬上告知負(fù)責(zé)人購買,以免耽誤使
2、用。(5)感受態(tài),氨芐青霉素和IPTG由研究生輪流負(fù)責(zé)制備。每人負(fù)責(zé)六個(gè)月。其他試劑則由第一位使用新包裝的同學(xué)分裝。由于分子實(shí)驗(yàn)工具酶比較容易失活,必須在冰上進(jìn)行分裝。二、常見抗生素及IPTG的配置以氨芐青霉素為例:1.準(zhǔn)備足夠量的1.5ml的EP管、兩個(gè)100ml的離心管、0.22μm水系濾器、注射器、蒸餾水,以上用品均要進(jìn)行高壓滅菌。2.潔凈工作臺(tái)紫外滅菌,然后進(jìn)行以下操作。3.稱取2g的氨芐青霉素粉末于離心管中,加入滅菌水至總體積為20ml,輕搖離心管,至氨芐青霉素粉末完全溶解,以免過濾時(shí)堵塞濾膜。4.用注
3、射器吸取配制好的溶液,然后把濾器安在注射器上,緩緩?fù)苿?dòng)注射器活塞,把溶液經(jīng)濾膜推至100ml的離心管中。注意:動(dòng)作要緩和,使濾出液出口正對(duì)著離心管,還要防止染菌。5.把100ml離心管中已除菌的氨芐青霉素溶液分裝到1.5ml的EP管中,每管0.5ml。在EP管上做好標(biāo)記,包括名稱、濃度、日期等。6.把做好標(biāo)記的盛有氨芐青霉素的EP管于-20℃保存。注意:當(dāng)你發(fā)現(xiàn)你使用的是最后一管抗生素時(shí),請(qǐng)馬上告知有關(guān)人員及時(shí)配制,以免耽誤使用。表1.常見抗生素的儲(chǔ)存濃度及工作濃度名稱儲(chǔ)存濃度工作濃度氨芐青霉素(ampicill
4、in)100mg/ml50μg/ml~100μg/ml卡那霉素(kanamycin)10mg/ml10μg/ml~50μg/ml氯霉素(chloramphenicol)25mg/ml12.5μg/ml~25μg/ml鏈霉素(streptomycin)50mg/ml10μg/ml~50μg/ml四環(huán)素(tetracyyline)10mg/ml10μg/ml~50μg/mlIPTG1M0.05-0.6mM三、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中各種試劑與溶液的配制參見《分子克隆》。四、總DNA的提取具
5、體步驟參考試劑盒說明書。注意:革蘭氏陽性菌DNA提取時(shí)需要加溶菌酶。五、基因擴(kuò)增1.引物與合成:設(shè)計(jì)引物序列,發(fā)至生工公司進(jìn)行合成(jinan@sangon.com)。2.引物配制:合成后的引物先離心至管底,然后按說明書用無菌水稀釋至10-50μM,分裝至無菌EP管中,做好標(biāo)記(一定要標(biāo)記濃度?。┖?,于-20度保存?zhèn)溆谩?.PCR反應(yīng)體系配制:將所需各組分在冰浴中化開后,進(jìn)行PCR反應(yīng)體系配制。反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)按不同聚合酶的說明書進(jìn)行,以transgen的easyTaq酶擴(kuò)增1kb基因序列為例,100μl反應(yīng)體
6、系為:10×buffer10μl,dNTP(10mM)2μl,引物各2μl(10-50μM),模板1μl(根據(jù)濃度加減體積),Taq酶1μl,ddH2O82μl(注意:加入順序?yàn)椋核?,buffer,dNTP,引物,模板,酶)。渦旋混勻,分裝至四-五管,瞬時(shí)離心。注意:若反應(yīng)時(shí)間較長在反應(yīng)混合液的上層加10-20μl的礦物油防止樣品在PCR的過程中蒸發(fā)。4.將管放入PCR儀中,在PCR儀上設(shè)置好PCR反應(yīng)參數(shù),例如:94℃5min,94℃40sec,Tm55℃1min,72℃2min,72℃10min,16℃1h,
7、一般設(shè)30個(gè)循環(huán)。待溫度降至16℃后停止PCR儀,盡快取出樣品,不允許過夜。六、瓊脂糖核酸電泳1.電泳緩沖液的配制:電泳緩沖液一般為TAE(或TBE),其配制方法參見表2,先配制50×母液放于4度冰箱中,電泳時(shí)稀釋100倍使用。2.將制膠模具和梳子沖洗干凈,架好梳子;3.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠(表3):準(zhǔn)確稱量瓊脂糖干粉,加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi),定量加入電泳緩沖液;4.放入到微波爐內(nèi)加熱至膠粒全部熔化(一般沸三次即好),冷卻片刻,倒入制膠模具中,待其凝固;a)室溫下30-4
8、5分鐘后凝膠完全凝結(jié),小心拔出梳子,將凝膠安放在電泳槽內(nèi);b)向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mm為宜,如樣品孔內(nèi)有氣泡,應(yīng)設(shè)法除去;c)在DNA樣品中加入1/5-1/10體積的上樣緩沖液(1%SDS,50%甘油,0.05%溴酚藍(lán)),混勻后,用槍將樣品混合液緩慢加入被浸沒的凝膠加樣孔內(nèi);5.接通電源,紅色為正極,黑色為負(fù)極,切記DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng)(靠近加