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1、動物病毒學試驗技術楊潤德通過病毒學的學習，我們了解到病毒沒有完整的酶系統(tǒng)，體內(nèi)無核糖體等細胞器，因此不能在任何無生命的培養(yǎng)液中生長。所以要想增殖病毒必須在有生命的組織細胞內(nèi)接種讓其增殖，如：動物、雞胚、細胞、器官。實驗一、雞胚接種發(fā)育中的雞胚是病毒生長良好的環(huán)境，被廣泛用于病毒（特別是禽病毒）的分離培養(yǎng)和疫苗生產(chǎn)等。病毒在雞胚中的生長可以通過幾種方法加以測定，如：采集尿囊液、羊水、絨尿膜、雞胚作定量檢定；采集以上樣品作血凝滴定、血清學試驗等；檢查各部的病理學變化，如：雞胚死亡、矮小、出血、羽毛發(fā)育不良、內(nèi)臟壞死灶
2、、絨尿膜水腫或增厚、壞死性痘斑、出血。除雞胚外，根據(jù)病毒特點可以選用其他禽胚，如小鵝瘟病毒宜接種鵝胚，鴨瘟宜接種鴨胚等。影響病毒在雞胚中生長的因素，包括雞胚的日齡、接種途徑、接種劑量、接種濃度、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)溫度一般為35.5-37℃，有些病毒所需的溫度更低。但很多哺乳動物病毒不適合在雞胚中生長。1.選取SPF雞群所產(chǎn)的蛋；2.受精卵在10℃左右保存不超過10d；3.最好選擇白色卵殼的受精卵；4.卵殼無污染，孵化前在0.1%的新潔爾滅中浸泡約15min，最后用冷水沖洗，放卵架，或?qū)⒙逊怕鸭苡眉兹?m2
3、用13ml甲醛、6.5gKMnO4熏蒸，而且在熏蒸時維持箱內(nèi)溫度為37℃20min后驅(qū)散甲醛蒸汽；5.孵化溫度保持39-40℃，相對濕度60-65%，有風扇維持空氣流通，每天翻蛋3-4次。一、受精卵的質(zhì)量和孵化根據(jù)不同病毒的嗜性，選擇適宜的接種途徑。最常用的途徑有卵黃囊、尿囊腔、尿囊膜3種途徑，偶爾接種于羊膜腔、靜脈、胚體等。在分離一種未知病毒時，最好3種途經(jīng)均用，如果沒有足夠的受精卵，首選絨尿膜接種途徑，因為大多數(shù)病毒都能適應。接種材料的處理：將組織置研缽磨碎，加5-10倍鹽水并加入雙抗混均，2000-3000
4、r/min離心20-30min。取上清待用。二、接種途徑卵黃是胚胎的營養(yǎng)物質(zhì)，卵黃囊膜是由內(nèi)胚層發(fā)育而來的，內(nèi)層覆有一層絨毛。病毒可在絨毛細胞內(nèi)生長，并且可以由此擴散到胚胎的其他部位。㈠卵黃囊1.取5-8日齡雞胚，在照卵器上畫出氣室和胚胎的位置；2.直立于卵座上，于氣室部碘酊消毒后打孔；3.用注射器取病料直刺入3cm回吸，如有卵黃吸出，推入毒液0.2-0.5ml，拔出針頭封口。放孵化器中繼續(xù)孵化，每天照卵2-3次。接種方法尿囊是雞胚的排泄器官。腔內(nèi)充滿排泄物尿囊液。液體的容量因卵的大小而異，一般6日齡雞胚時約1m
5、l，11日齡時約6ml，13日齡可高達10ml，以后逐漸減少直到消失。13日齡時的尿囊液是無色透明的，14日齡后逐漸變渾濁，呈乳白色，有時淡黃色。㈡尿囊腔接種1.取9-10日齡雞胚，照卵，畫出氣室，離氣室邊緣0.3-0.5cm用鉛筆作一記號；2.在氣室做記號處用碘酊消毒，打孔；3.用注射器取毒液自接種孔斜刺入約1cm，注入毒液0.1-0.2ml；4.封孔繼續(xù)孵化，定時照蛋。接種方法絨尿膜是雞胚的呼吸器官，由尿囊膜和絨毛膜緊密粘合組成，無法分開。絨尿膜上有豐富的血管，照蛋時清晰可見。㈢絨尿膜接種方法一將待檢液滴在氣
6、室膜上，透過卵膜擴散到絨尿膜上。原理是氣室卵膜性脆，刺破后不再閉合，而絨尿膜是活組織，有韌性刺破后能立即閉合，接種液不能透過。接種方法1.取9-10日齡雞胚，照卵器畫出氣室范圍；2.將卵直立于卵架上，氣室向上，于中央消毒打孔；3.以1ml注射器配以2.5cm5-6號針頭，自小空刺入氣室約0.5cm，滴加待檢液0.1-0.2ml于氣室內(nèi)的卵膜上，將針頭繼續(xù)垂直刺入，拔出針頭，封口，繼續(xù)孵化定時翻蛋?？呻S意放置。方法二此法做人工氣室，能保證毒液接種在絨尿膜上。1.取9-10日齡雞胚，畫出氣室及胚胎位置中的無血管區(qū)；2
7、.將卵橫臥于卵架上，胚胎位置向上；3.在胚胎部位及氣室部碘酊消毒，氣室中央打孔，胚胎部位用鋼鋸劃破卵殼但不破壞絨尿膜；4.用橡皮吸球吸氣室部的空氣，使卵內(nèi)容物移向氣室，促使破殼部位的絨尿膜下陷，形成人工氣室；5.自人工氣室接種待檢物0.1-0.2ml；6.將卵殼移回原位或用滅菌玻璃紙封口用膠布固定；7.將卵放回孵卵箱繼續(xù)孵育，人工氣室向上，每日檢卵2-3次。㈠檢查雞胚接種待檢材料后孵化1-6d，此期間每天最少檢卵2次。接種24h死亡胚一般視為非特異性死亡，棄去。以后死亡胚立即取出放置4℃內(nèi)至少4h，以使血管收縮。
8、冷藏時間不得超過24h，否則胚液蒸發(fā)，氣室卵膜難于剝離，影響病毒的收獲。三、雞胚接種后的檢查和收獲㈡雞胚內(nèi)容物的收獲1.尿囊液的收獲⑴將卵直立于卵架上，氣室向上；⑵氣室部碘酊消毒，擊破并除去卵殼；⑶用滅菌鑷子撕去氣室部的卵膜及絨尿膜，可見尿囊液澄清透明；⑷用吸管或注射器采集尿囊液，菌檢棄去細菌污染的尿囊液。2、羊水的收獲⑴1-4與尿囊液的收獲一樣；⑵吸取尿囊液后用鑷子提起
