病毒學實驗技術

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1、病毒學實驗技術實驗一雞胚接種器材：雞胚打孔器注射器針頭照蛋燈蛋座病毒液石蠟碘酊棉球酒精棉球雞胚孵化f病毒接種（NDV、EDS—76、IBV-＞效價測定（HA、H1）一.精卵的選擇、孵育和檢卵1.受精卵的選擇1）最好來自SPF雞群，以降低母源抗體的影響2）最好是白克蛋3）受精卵必須新鮮，保存在5-20°C不要超過10天，保存一個月的受精卵，孵化率將近于零。2.孵育1）孵箱溫度保持37.5—38.5°C2）相對濕度:50-60%3）保證新鮮空氣流通，尤孵化5-6天后4）孵育后第三天開始，每天翻卵一次3.檢卵

2、孵育后第4天開始，每天檢卵一次。4日卵可見血管。未受精卵不見血管雞胚。死胚血管模糊，無胎動。二.雞胚的結構1.卵殼上有細孔，以行氣體交換2.殼膜行氣體和液體分子交換，故須一定濕度和氣流3.氣室呼吸和調節(jié)壓力4.絨毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管一02—卵売孔交換5.尿囊腔胚胎排泄器官，冰囊液初為通明，12-13天后因球酸鹽增多而漸渾濁。6.羊膜腔胚胎浸泡于其屮羊水7.卵黃早期養(yǎng)分8.卵白晚期養(yǎng)分三.接種前處理1?做接種記號2.消毒四.接種途徑卵黃囊、球囊腔、絨毛球囊膜、羊膜腔、靜脈、胚體1.卵黃囊接種法蟲媒

3、披膜病毒、衣原體、立克氏體等分離和增殖方法一：1）6-8H齡胚，畫岀氣室和胚位，大頭朝下方法二2）碘及酒精消毒氣室端3）鋼錐在氣室屮央錐一小孔4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm,0.1-0.3ml/胚5）熔蠟封孔，續(xù)孵，棄24H內(nèi)死胚1）2）同一3）卵橫放，胚朝下，卵長1/2處消毒4）鋼錐錐一小孔,注射器吸取病毒液,沿小孔垂直刺入1.5CM,0.1-0.5ml/胚5）封孔，續(xù)孵，棄24h內(nèi)死胚2.絨毛尿囊膜接種法痘病毒和皰殄病毒分離和増殖方法一：1）10-12n齡胚，畫氣室，消毒2）在氣室端開一

4、1.5X1.5口3）滅菌銀子撕去一小片內(nèi)殼膜4）滴入接種物5）膠布或透明紙封口方法二：（人工氣室）1）在胚胎附近近氣室處，選血管少處，烙一直徑3-4mm的烤焦圈］2）消毒，刀撬起卵殼造成卵窗3）在氣室端中央鉆一個小孔4）用針尖挑破卵窗中心的殼膜，勿損傷其下的絨毛尿囊膜，滴加生理鹽水于刺破出5）橡皮乳頭于小孔上吸氣，形成人丄氣室，可見絨毛丿永囊膜上滴加的生理鹽水卜?滲6）用lmlL注射器滴2-3滴接種物于絨毛尿囊膜上7）膠布或透明紙封口，熔蠟封孔8）雞胚橫臥孵育，勿翻動，卵窗向上2.尿囊腔接種法用于止粘病

5、毒，副粘病莓分離和增殖1）選10-12日齡胚，畫氣室胚位，消毒2）鋼錐錐一小孔3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-lcm,0.1-0.2/胚4）熔蠟封孔，續(xù)孵，檢卵1次/天，棄24h內(nèi)死胚靜脈接種：藍舌病毒；腦內(nèi)接種：狂犬病毒實驗二原代細胞培養(yǎng)（雞胚成纖維細胞）器材：雞胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋燈蛋座大剪子眼科剪銀子平皿培養(yǎng)基胰酶水浴鍋大青霉素瓶吸管吸球細胞瓶瓶塞一.實驗目的：了解原代細胞培養(yǎng)的一般方法和用途二.實驗步驟：1.取9-12H齡雞胚，依次用碘酊和酒精消毒2.無菌夾起雞胚置于無菌平皿3?眼科

6、剪銀去頭、四肢及內(nèi)臟，Hank'S洗液兩次3.剪碎近于乳糜狀4.將剪碎組織倒入錐形瓶或燒杯或大青霉素瓶，Ilank，S兩次，然后加入4倍量的（5ml）0.25%胰酶，調PH值7.6-7.8（NaHCO35.6%^7.5%、8.8%）,混勻后置37°C水浴20-30分鐘,期間每lOmin搖動一次，使細胞消化完全（組織塊變松散，沉降變緩慢時表示消化足夠）5.消化好后，取出瓶子，靜置幾分鐘，洗去胰晦液，加含有犢牛血清的Hank，S液生長液約10ml,輕搖后吸去，重復一次，冃的洗去殘留的胰酶和抑制其消化作用6.

7、加入生長液10ml,以粗口吸管吹吸數(shù)次，使細胞脫落分散，靜置1-2分鐘，使組織塊下降，輕吸出細胞懸液于離心管屮&平衡后以2000r/minl0min,棄上清，用10mlHank'S液生長懸浮沉淀，分裝于兩個細胞瓶屮，2ML/瓶。使細胞量約為50萬個/ml,再補加Hank,S生長液至10mb37°C培養(yǎng)實驗三傳代細胞培養(yǎng)（傳代細胞二遺傳突變/理化學物質作用/致瘤病毒作用二異倍體癌變細胞；多來門動物或人的腫瘤組織及部分來白突變的正常細胞。成長旺盛，繁殖快速，但易遭支原體和病毒污染—細胞源性/非-細胞源性如毒

8、種、血清、胰酶、操作人員口鼻手等）一、試劑1.細胞分散劑：0.25%胰酶，250ML裝，4°C保存胰酶2.5gNaCl8.0gKCL0.2gNa2HPO4?12H.02.89gKH.POi0.2g加ddH20至1000ml加壓過濾除菌,分裝于小瓶備用。（細胞消化液:將胰酶2?5g、NaCl80.0g.KCL4.0g、葡萄糖10.0g、NaHCO35?8g依次溶于900.0mlddH20中,待完全溶解后,定容至1000.0ml,過濾除菌，分裝