基于載體的rna干擾技術(shù)

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1、BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications《生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究通訊》題目：基于載體的RNA干擾導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因斑馬魚中肌肉生長抑制素基因抑制從而引起雙肌效果摘要：肌肉生長抑制素屬于轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β超家族，對骨骼肌的形成和增長具有很強的負(fù)調(diào)節(jié)作用。我們利用顯微注射反義RNA的表達(dá)載體，構(gòu)建了一個肌肉生長抑制素基因抑制而產(chǎn)生雙肌表型并且能遺傳穩(wěn)定的斑馬魚品種。實時PCR和免疫染色顯示，在純合的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中肌肉生長抑制素mRNA和蛋白水平分別是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏?3％和26％。此外，肌肉生長抑制素抑制的轉(zhuǎn)基因魚MyoD、肌細(xì)胞生成素、Mr

2、f4和Myf5這類生肌調(diào)節(jié)因子的mRNA水平相比于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼酗@著的升高。雖然在體長上沒有顯著的差異，但純合的轉(zhuǎn)基因斑馬魚比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩?5％。組織化學(xué)分析表明，純合轉(zhuǎn)基因魚的肌纖維的橫截面積是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏膬杀?。這是第一個能穩(wěn)定遺傳的肌肉生長抑制素抑制基因型以及雙肌表型的斑馬魚模型。關(guān)鍵詞：肌肉生長抑制素斑馬魚RNA干擾前言：McPherron和Lee在BelgianBlue和Piedmontese這兩種牛中發(fā)現(xiàn)了對肌肉的生長具有負(fù)調(diào)節(jié)作用的肌肉生長抑制素。作為肌肉生長的調(diào)節(jié)物質(zhì)，肌肉生長抑制素一般在骨骼肌中表達(dá)，是屬于轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β超家族，擁有該超家族所有共同的結(jié)構(gòu)組分。

3、在許多種牛和小鼠中，肌肉生長抑制素的基因突變會導(dǎo)致“雙肌”現(xiàn)象。此外，在豬和雞中也觀測到類似的肌肉生長抑制素的表達(dá)模式。在成年哺乳動物中，肌肉生成抑制素主要是在該物質(zhì)的靶組織——骨骼肌中表達(dá)。然而，隨后在研究中發(fā)現(xiàn)肌肉生長抑制素在乳腺、心臟、脾、腦中也有較低水平的表達(dá)，它會影響心肌的生長以及脂肪細(xì)胞的分化。由于在子宮內(nèi)進行研究比較困難，因此肌肉生長抑制素在哺乳動物胚胎發(fā)育時的表達(dá)模式大多仍不清楚。在大鼠胚胎發(fā)育早期，肌肉生長抑制素只在體節(jié)中表達(dá)；而在胚胎發(fā)育后期，肌肉生長抑制素的表達(dá)始終伴隨著肌肉的生長。肌肉生長抑制素在魚類中不僅抑制骨骼肌生長，在維持組織穩(wěn)態(tài)增長、滲透壓調(diào)節(jié)以及生殖組織的功

4、能上也起著重要作用。相比于哺乳動物，人們在在不同品種的魚類的胚胎發(fā)育過程中，進行了許多定性和定量實驗來研究肌肉生長抑制素的表達(dá)情況。在斑馬魚中，發(fā)現(xiàn)了兩種形式的肌肉生長抑制素（Ⅰ和Ⅱ）的基因。肌肉生長抑制素Ⅰ的信使（m）RNA是母性遺傳的，在受精后48小時的胚胎中表達(dá)量達(dá)到最高；而肌肉生長抑制素Ⅱ在受精后13小時，也就是8-體節(jié)階段才能檢測到。對組織表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，肌肉生長抑制素Ⅰ基因廣泛表達(dá)于肌肉，大腦，眼睛，腎臟，睪丸，卵巢，消化道和心臟中，但肌肉生長抑制素Ⅱ的基因表達(dá)譜則比較有限，大都局限于大腦。只有肌肉生長抑制素Ⅰ的基因表達(dá)是在生長發(fā)育過程中是動態(tài)調(diào)節(jié)的，而肌肉生長抑制素Ⅱ基因的表達(dá)

5、在生長發(fā)育的大多數(shù)情況下是不變的。肌肉生長抑制素的功能是對骨骼肌生長進行負(fù)調(diào)節(jié)。通過同源基因靶向的方法培育的小鼠骨骼肌明顯比野生型（WT）小鼠的要大，由于細(xì)胞數(shù)量（增生性增長）和細(xì)胞大?。ǚ屎裥栽鲩L）的增長，肌肉生長速率比野生型小鼠大2到3倍以上的。在哺乳動物中，RNA干擾（RNAi）技術(shù)通常用來獲得肌肉生長抑制素基因抑制的動物。在魚類中，有一些研究肌肉生長抑制素消除的斑馬魚的報告。Amali等人通過對發(fā)育早期的胚胎顯微注射反義寡核苷酸發(fā)現(xiàn)體節(jié)的數(shù)量和大小在這一發(fā)育期有所增加。他們還發(fā)現(xiàn)，與肌肉生長相關(guān)的肌肉轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（MyoD）和肌細(xì)胞生成素（myogenin）基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)。Xu等人發(fā)

6、現(xiàn)能過度表達(dá)對肌肉生長抑制素具有顯性失活作用的前導(dǎo)肽的轉(zhuǎn)基因斑馬魚中，肌肉細(xì)胞數(shù)量僅略有增加，而且僅在雌魚中。Acosta等人通過顯微注射羅非魚肌肉生長抑制素的雙鏈（ds）RNA到斑馬魚的卵中，培育出了“巨型斑馬魚”。雖然難以確定何種肌肉生長抑制素基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的構(gòu)型或肌肉生長抑制素的橫向同源物在上述研究中起作用，但這些研究表明，魚類肌肉生長抑制素的生物功能可能不僅限于骨骼肌生長和發(fā)育的負(fù)調(diào)控。由于目前在魚類中還沒有能進行基因敲除的技術(shù)，而且在魚類中也沒有種系穩(wěn)定的基因抑制模式動物，因此我們使用一種基于載體的RNA干擾方法來獲得遺傳穩(wěn)定的肌肉生長抑制素基因敲除的模型魚來研究肌肉生長抑制素在斑馬

7、魚中的功能。這是第一個遺傳穩(wěn)定的肌肉生長抑制素抑制的斑馬魚種，能夠用來研究肌肉生長抑制素基因的表達(dá)和功能。材料和方法魚的飼養(yǎng)斑馬魚（斑馬魚類）是從本地水族用品店購買的。在28℃的溫度、20-L的光照強度以及14h:10h的日/夜周期下養(yǎng)殖。用于顯微注射的受精卵是在光期開始后的單細(xì)胞階段收集的。反義肌肉生長抑制素綠色熒光蛋白（GFP）質(zhì)粒的構(gòu)建肌肉生長抑制素Ⅱ基因（也就是肌肉生長抑制素ⅡAY687474）是從受