羧基熒光素乙酰乙酸對大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外染色的研究

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1、羧基熒光素乙酰乙酸對大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外染色的研究【摘要】　　目的探討活體染料羧基熒光素乙酰乙酸標(biāo)記大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的可行性和最適條件。方法清潔型SD大鼠20只，用密度梯度離心結(jié)合貼壁法分離、純化、培養(yǎng)大鼠MSCs，取長滿2cm×2cm培養(yǎng)瓶瓶底的第3代大鼠MSCs，用，5，10，20，40μmol/L的CFSE分別作用1，5，10，15，20min后染色，通過觀察染色后細(xì)胞熒光強度和細(xì)胞貼壁率篩選出CFSE標(biāo)記大鼠MSCs的最佳標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度。采用MTT法檢測最佳條件CFSE標(biāo)記的大鼠MSCs的增殖能力。結(jié)果濃度10μmol/L

2、的CFSE在3℃下孵育10min為MSCs染色、觀察和研究的最佳條件。此條件下，CFSE標(biāo)記的MSCs的增殖能力不受影響。結(jié)論活體染料CFSE是一種標(biāo)記率高、細(xì)胞毒性小、操作簡便的標(biāo)記大鼠MSCs的新方法，濃度10μmol/L的CFSE在3℃下孵育10min為CFSE標(biāo)記大鼠MSCs的最佳條件?！娟P(guān)鍵詞】熒光素；乙酰乙酸鹽類；骨髓細(xì)胞；間質(zhì)干細(xì)胞；染色與標(biāo)記；大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞是骨髓內(nèi)的非造血干細(xì)胞，具有來源廣泛、取材容易、在體外長期培養(yǎng)過程中始終保持其多向分化潛能、體內(nèi)移植反應(yīng)弱、克服了有關(guān)倫理學(xué)及免疫排斥問題等優(yōu)點，是組織工程和細(xì)胞移

3、植治療的最佳種子細(xì)胞[12]。為研究MSCs的移植療效，需對MSCs在體內(nèi)的存活、遷移、分布及增殖、分化進(jìn)行監(jiān)測，因此需要有效的標(biāo)記方法區(qū)別供體細(xì)胞和受體細(xì)胞。已有的標(biāo)記物如放射性探針、熒光素探針和綠色熒光蛋白等用于MSCs標(biāo)記，但在應(yīng)用過程中也存在諸多問題。活體染料羧基熒光素乙酰乙酸是一種可穿過細(xì)胞膜、自動而且不可逆地與胞內(nèi)蛋白和膜表面蛋白結(jié)合的熒光染料，近年來在神經(jīng)科學(xué)和免疫學(xué)已有廣泛應(yīng)用[3]。但CFSE對不同細(xì)胞體外染色的標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度不同[4]。為探討CFSE標(biāo)記大鼠MSCs的最佳標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度，筆者應(yīng)用CFSE對體外

4、培養(yǎng)的大鼠MSCs染色進(jìn)行系統(tǒng)研究，報告如下?！?材料與方法材料實驗動物選用清潔級健康雄性SD大鼠20只，2～3月齡，體質(zhì)量150～250g[福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號SCXK(閩XX－0008)]。主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS；胰蛋白酶；PBS、FicollPaque分離液；染料CFSE；熒光標(biāo)記小鼠抗大鼠單克隆抗體CD34PE、CD45FITC、CD29FITC、CD90FITC(美國PharMingen公司)；ThermoFormaCO2孵育箱，BeckmancounterEpicsXL流式細(xì)胞

5、儀，倒置相差顯微鏡，倒置相差熒光顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡(德國LEIca公司)。方法MSCs的培養(yǎng)、傳代與鑒定大鼠氯胺酮腹腔注射麻醉，濃碘伏消毒。取雙側(cè)四肢骨，剪除干骺端，暴露骨髓腔，用10mL培養(yǎng)液沖洗骨髓腔。將所獲骨髓緩慢加入已含F(xiàn)icollPaque分離液mL的試管內(nèi)梯度離心，吸取富含粒細(xì)胞中間界面層，PBS洗滌3次，制成單細(xì)胞懸液接種。培養(yǎng)條件為3℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為的CO2，培養(yǎng)液為DMEM。每3～d更換1次培養(yǎng)液，去除未貼壁細(xì)胞，至細(xì)胞融合時胰酶消化收集細(xì)胞，傳代并檢測CD34、CD45、CD29、CD90。CFSE染色

6、及最佳條件篩選.mgCFSE用500μL二甲基亞楓溶解，制成10mmol/L的儲存液，放于－20℃冰箱內(nèi)保存。臨用前取適量，用MSCs培養(yǎng)基分別稀釋成，5，10，20，40μmol/L的不同濃度。取長滿2cm×2cm培養(yǎng)瓶瓶底的第3代大鼠MSCs6瓶，其中1瓶做等量空白對照，其余25瓶分5組，每組5瓶，分別加入含不同濃度CFSE的MSCs培養(yǎng)基mL，置3℃培養(yǎng)箱分別孵育1，5，10，15，20min。用PBS漂洗3次，490nm激發(fā)波長熒光顯微鏡下觀察CFSE標(biāo)記情況。標(biāo)記率為：　　標(biāo)記率＝暗視野所見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/明視野所見的細(xì)胞數(shù)

7、×100％30nm發(fā)射波長激光共聚焦顯微鏡下測定細(xì)胞熒光強度。隨后用%胰酶1mL消化，離心管離心。棄去上清，用含10%FBS培養(yǎng)基mL吹打成單細(xì)胞懸液。每瓶取1mL懸液進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，觀察MSCs的存活率：　　存活率＝光鏡下活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100％其余懸液按1∶2的比例接種于2cm×2cm培養(yǎng)瓶中，2h后觀察記錄MSCs的貼壁率：　　貼壁率＝(倒置相差顯微鏡下接種細(xì)胞數(shù)－未貼壁的細(xì)胞數(shù))/接種細(xì)胞數(shù)×100％上述步驟重復(fù)4次，通過統(tǒng)計學(xué)分析篩選出CFSE標(biāo)記大鼠MSCs的最佳標(biāo)記時間和標(biāo)記濃度。標(biāo)記細(xì)胞增殖能力檢測取第3代MSCs接種

8、于96孔板中，每孔體積100μL，細(xì)胞數(shù)為1×103。實驗分2組：CFSE標(biāo)記組和未標(biāo)記組，每組35孔，每天相同時間每組各取5孔細(xì)胞，加入MTT溶液20μL,3℃培養(yǎng)箱孵育h后用全自動酶標(biāo)儀在