課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) (3)

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1、微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2:土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)一、課題目標(biāo)研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用，進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定。二、課題重點(diǎn)與難點(diǎn)重點(diǎn)：對(duì)土樣的選取和選擇培養(yǎng)基的配制。難點(diǎn)：對(duì)分解尿素的細(xì)菌的計(jì)數(shù)。三、研究思路微生物的選擇培養(yǎng)，是指利用培養(yǎng)基的組成使適宜生長(zhǎng)的特定微生物得到較快繁殖的技術(shù)，也稱為微生物的“選擇培養(yǎng)”。（一）篩選菌株在本課題提供的選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培養(yǎng)基中的惟一氮源，因此，原則上只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。但實(shí)際上，微生物的培養(yǎng)是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有些微生物可以利用其他微生物的代謝產(chǎn)物生長(zhǎng)繁殖，因此能夠在選擇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

2、的微生物不一定是所需要的微生物，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。（二）統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的理論依據(jù)是：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。因此，恰當(dāng)?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，通常將幾個(gè)稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。思考題1.想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同；

3、二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。（三）設(shè)置對(duì)照究竟是哪個(gè)原因，可以通過實(shí)驗(yàn)來證明。另一種方案：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。實(shí)驗(yàn)方案有兩種一種方案：可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。四、實(shí)驗(yàn)案例實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下:1.土壤取樣從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。土壤中某樣品細(xì)菌的分離

4、與計(jì)數(shù)準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目應(yīng)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作為對(duì)照，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，因此共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。此外，還需要準(zhǔn)備8個(gè)滅菌的試管和1個(gè)滅菌的移液管。2.制備培養(yǎng)基將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸取上清液

5、1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL的生理鹽水的無菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。3.微生物的培養(yǎng)與觀察將涂布好的培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，會(huì)有不同的菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如課本中圖2-10的顏色反應(yīng)。為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍

6、相同嗎？答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。思考題4.細(xì)菌的計(jì)數(shù)當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、

7、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。五、操作提示無菌操作做好標(biāo)記規(guī)劃時(shí)間六、課題成果與評(píng)價(jià)（一）培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落對(duì)照的培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基的菌落數(shù)目明顯大于選擇培養(yǎng)基的數(shù)目，說明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。伊紅—美藍(lán)培養(yǎng)基是鑒別培養(yǎng)基，可以用來檢測(cè)自來

8、水中的大腸桿菌是否超標(biāo)，