學習植物組織培養(yǎng)技術(shù)

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1、學習植物組織培養(yǎng)技術(shù)一、教學目的1.理解植物組織培養(yǎng)技術(shù)的基本原理、目的要求和方法步驟。2.初步掌握植物組織培養(yǎng)的操作技能。二、參考資料培養(yǎng)基的配制植物組織培養(yǎng)中常用的一種培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基的配制包括以下步驟。培養(yǎng)基母液的配制和保存MS培養(yǎng)基含有近30種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對這幾十種成分進行稱量，可將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20（50mL）或1/200（5mL），加水稀釋，制成培養(yǎng)液。現(xiàn)將制備培養(yǎng)基母液所需的

2、各類物質(zhì)的量列出，供配制時使用。大量元素(母液Ⅰ)mg／LNH4NO333000KNO338000CaCl2·2H2O8800MgSO4·7H2O7400KH2PO43400微量元素(母液Ⅱ)KI166H3BO31240MnSO4·4H2O4460ZnSO4·7H2O1720Na2MoO4·2H2O50CuSO4·5H2O5CoCl2·6H2O5鐵鹽(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O5560Na2-EDTA·2H2O7460有機成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇20000ⅣB煙酸100鹽酸吡哆醇(維生素B6)100鹽酸硫胺素(維生素B1)100甘氨

3、酸400以上各種營養(yǎng)成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液。上述幾種母液都要單獨配成1L的貯備液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1L。母液Ⅲ的配制方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們?nèi)芙?，然后將兩種溶液混合，并將pH調(diào)至5.5，最后定容到1L，保存在棕色玻璃瓶中。各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標簽，注明母液號、配制倍數(shù)、

4、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。MS培養(yǎng)基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、6-芐基嘌呤（6BA）等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，并且分別配成母液（0.1mg/mL）。其配制方法是：分別稱取這3種物質(zhì)各10mg，將2，4-D和NAA用少量（1mL）無水乙醇預溶，將6BA用少量（1mL）的物質(zhì)的量濃度為0.1mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最后分別定容至100mL，即得質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的母液。配制培養(yǎng)液用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB

5、各5mL。再取2，4-D5mL、NAA1mL，與各種母液一起放入燒杯中。配制培養(yǎng)液時應注意：①在使用提前配制的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發(fā)現(xiàn)瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配制；②用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序?qū)懺诩埳?，量?種，劃掉1種，以免出錯。溶化瓊脂用粗天平分別稱取瓊脂9g、蒸糖30g，放入1000mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直

6、到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養(yǎng)液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1000mL，攪拌均勻。需要注意的是，在加熱瓊脂、制備培養(yǎng)基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙（5.4～7.0）測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH為5.8為止（培養(yǎng)基的pH必須嚴格控制

7、在5.8）。培養(yǎng)基的分裝溶化的培養(yǎng)基應該趁熱分裝。分裝時，先將培養(yǎng)基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養(yǎng)基倒入錐形瓶（50mL或100mL）中。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1000mL培養(yǎng)基，可分裝25～30瓶。培養(yǎng)基分裝完畢后，應及時封蓋瓶口。用2塊硫酸紙（每塊大小約為9cm×9cm）中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標簽。高壓滅菌培養(yǎng)基的高壓滅菌包括以下幾個步驟。第一，碼放錐形瓶。將裝有培養(yǎng)基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)。如果沒有

8、金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入高壓蒸氣滅菌鍋內(nèi)，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶（以上物品都要用牛皮紙封口），用牛皮紙包裹的培養(yǎng)皿、剪刀、解