多糖分離純化及含量測定1

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1、多糖的分離純化與含量測定張黎明天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院2013年4月29日生物制藥技術(shù)專題主要講授內(nèi)容一、多糖的提取方法二、多糖的純化方法三、多糖含量的測定方法四、純度與相對分子質(zhì)量的檢測polysaccharide;separation；extraction;isolationpurification;contentdetermination;前言多糖在早期的天然產(chǎn)物化學(xué)研究中,因活性不明顯,常作為無效成分棄去。由于化學(xué)、生物學(xué)、藥理學(xué)等學(xué)科的飛速發(fā)展,自20世紀(jì)80年代來,人們對多糖的生物活性有了新的認(rèn)識。藥理實(shí)驗(yàn)研究顯示,多糖具有許多生物活性功能,包括免疫調(diào)節(jié)、

2、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌、抗病毒、保護(hù)肝臟等,且對機(jī)體毒副作用小。因此,對多糖的研究開發(fā)已成為醫(yī)藥保健品行業(yè)熱門領(lǐng)域。如香菇多糖、靈芝多糖、云芝多糖已在國內(nèi)外臨床上廣泛應(yīng)用。而其他一些多糖正在深入研究,如桑黃多糖、豬苓多糖、人參多糖、枸杞多糖等。生物活性多糖主要有真菌多糖、植物多糖、動物多糖3大類。多糖的提取首先要根據(jù)多糖的存在形式及提取部位，決定在提取之前是否做預(yù)處理。動物多糖和微生物多糖多有脂質(zhì)包圍，一般需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進(jìn)行回流脫脂，釋放多糖；植物多糖提取時需注意一些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類，在提取前，應(yīng)先用低極

3、性的有機(jī)溶劑對原料進(jìn)行脫脂預(yù)處理。一、多糖的提取方法1.溶劑提取法水提醇沉法、酸提法、堿提法、超臨界流體萃取法2.酶解提取法單一酶解法、復(fù)合酶解法3.強(qiáng)化提取法超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、高壓脈沖法1.溶劑法：水提醇沉法多糖是極性大分子化合物，提取時應(yīng)選擇水、醇等極性強(qiáng)的溶劑。水提醇沉法是提取多糖最常用的一種方法。用水作溶劑來提取多糖時，可以用熱水浸煮提取，也可以用冷水浸提滲漉，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最終體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%左右，利用多糖不溶于乙醇的性質(zhì)，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置一定的時間，多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和得率均較高。影響多糖提取率的

4、因素有：水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數(shù)等。該種方法提取多糖不需特殊設(shè)備，生產(chǎn)工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產(chǎn)，是一種可取的提取方法。但由于水的極性大，容易把蛋白質(zhì)、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液存放時腐敗變質(zhì)，為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時，提取率也不高。溶劑法：酸提法為了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基礎(chǔ)上發(fā)展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團(tuán)的多糖在較低pH值下難以溶解；含有胺基的多糖可使用乙酸或鹽酸調(diào)節(jié)提取液成酸性進(jìn)行提取，然后再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入銅鹽等生成不溶性絡(luò)合物或鹽類沉淀而析出。影響多糖提取

5、率的因素有：水的用量、pH值、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數(shù)等。由于H＋的存在抑制了酸性雜質(zhì)的溶出，稀酸提取法提取得到的多糖產(chǎn)品純度相對較高；但在酸性條件下可能引起多糖中糖苷鍵的斷裂，且酸會對容器造成腐蝕，除弱酸外，一般不宜采用。因此酸提法也存在一定的不足之處。溶劑法：堿提法有的酸性多糖,或分子量較大的多糖,在熱水中溶解度不大,一般在稀堿溶液中溶解度較大,所以常用稀的NaOH溶液或Na2CO3溶液提取。不過用稀堿溶液提取時,提取溫度必須保持在10℃以下,否則多糖容易發(fā)生降解反應(yīng)。多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，例如粘多糖的提取多采用堿提取法。多糖堿法提取雖然可提高多

6、糖的收率,且可縮短提取時間,但提取液中含有其它雜質(zhì)如蛋白質(zhì),粘度過大,過濾困難,且有些多糖在堿性較強(qiáng)時會水解。通常先用熱水法提取,然后殘?jiān)儆孟A溶液提取,這樣可將大部分多種類型的多糖提取出來。溶劑法：超臨界流體萃取法超臨界流體是指物質(zhì)處于臨界溫度和臨界壓力以上時的狀態(tài)，這種流體兼有液體和氣體的特點(diǎn)，即密度大，粘稠度小，有極高的溶解，滲透到提取材料的基質(zhì)中，發(fā)揮非常有效的萃取功能。而且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大，提取結(jié)束后，再通過減壓將其釋放出來，具有保持有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)。超臨界流體萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術(shù)。由于CO2的超臨

7、界條件（TC＝31.26℃，Tp＝7.38MPa）容易達(dá)到，常作為超臨界萃取的溶劑，在壓力為8～40MPa時的超臨界CO2足以溶解任何非極性、中極性化合物，在加入夾帶劑后則可溶解極性化物。由于糖類的化合物分子量較大、羥基多、極性大，用純二氧化碳提取產(chǎn)率較低，加入夾帶劑或加大壓力則可提高提取率。該法的缺點(diǎn)是設(shè)備復(fù)雜，運(yùn)行成本高，提取范圍有限。2.酶解法：單一酶解法單一酶解法是指使用一種酶來提取多糖，從而提高提取率的生物技術(shù)。其中經(jīng)常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。蛋白酶對植物細(xì)胞中游離的蛋白質(zhì)具有分解作用，使其結(jié)構(gòu)變得松散；蛋白酶還會使糖蛋白和蛋白聚糖中