針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)乳腺增生大鼠血清及乳腺vegfbfgf含量的影響課件

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1、針?biāo)幗Y(jié)合對(duì)乳腺增生大鼠血清及乳腺VEGF、bFGF的影響河北醫(yī)科大學(xué)杜惠蘭靳亞慈乳腺增生病育齡期婦女的常見(jiàn)病，多發(fā)病發(fā)病率占全部乳房疾病的74.1%，且有逐年上升的趨勢(shì)患病人群乳腺癌發(fā)生率較普通人群高2～3倍因此,積極治療乳腺增生病，對(duì)預(yù)防其發(fā)生癌變、提高婦女生活質(zhì)量具有重要意義。目前，西醫(yī)對(duì)本病尚缺乏令人滿意的治療措施，其內(nèi)分泌療法副作用較大，長(zhǎng)期使用可干擾體內(nèi)激素的平衡，不宜作為常規(guī)用藥。乳腺增生病屬于中醫(yī)“乳中結(jié)核”、“乳疬”等范疇中醫(yī)治療乳腺增生病積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)單純服用中藥單純應(yīng)用針灸如何進(jìn)一步提高療效，縮短療程，成為研究重點(diǎn)中藥和針灸作為中醫(yī)學(xué)的兩大療法，

2、經(jīng)曰：“湯藥攻其內(nèi)，針灸攻其外，則病無(wú)所逃矣”。兩者各有長(zhǎng)短，合用則相得益彰。乳腺增生病在病理方面除了表現(xiàn)在上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、腺泡、導(dǎo)管等組織的增生外，亦存在著血管的增生。目前血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生成因子（bFGF）被認(rèn)為是乳腺癌特異性最強(qiáng)的兩種血管因子。推測(cè)乳腺增生中血管的生成可能與VEGF和bFGF密切相關(guān)。因此，我們采用肌注外源性激素的方法復(fù)制乳腺增生大鼠模型，應(yīng)用放免和免疫組織化學(xué)技術(shù)探討乳腺增生病變與血清、乳腺VEGF和bFGF的關(guān)系以及針?biāo)巺f(xié)同作用對(duì)血清、乳腺VEGF和bFGF的調(diào)節(jié)治療機(jī)制。材料與方法動(dòng)物：清潔級(jí)雌性Wistar大鼠

3、60只，75~85日齡，220±20g由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：602089藥物和試驗(yàn)試劑中藥(柴胡、郁金、川楝子、王不留行、荔枝核、山慈菇等)采用傳統(tǒng)煎煮方法，過(guò)濾，離心，濃縮制成水煎液，含生藥2.75g/ml，密封分裝，4℃放置備用苯甲酸雌二醇、黃體酮均由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)枸櫞酸他莫昔芬（TAM）由上海醫(yī)藥集團(tuán)有限公司華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)VEGF和bFGF酶聯(lián)免疫試劑盒，購(gòu)于美國(guó)R-D公司。E2、P放免試劑盒購(gòu)于美國(guó)DSL公司。PRL放免試劑盒購(gòu)于天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司。動(dòng)物分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為6組，每組10只：正常

4、組模型組模型+針刺組（簡(jiǎn)稱“針刺組”）模型+中藥組（簡(jiǎn)稱“中藥組”）模型+針刺+中藥組（簡(jiǎn)稱“針?biāo)幗M”）模型+TAM陽(yáng)性對(duì)照組（簡(jiǎn)稱“對(duì)照組”）復(fù)制模型正常組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)其余組參照張璐[2]等造模方法，大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇0.5mg/kg/日，連續(xù)25天，然后注射黃體酮5mg/kg/日，連續(xù)5天，建立大鼠乳腺增生模型。治療方法從第31天開(kāi)始，各組分別治療:針刺組：根據(jù)《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》結(jié)合人體穴位，選取屋翳、合谷、膻中、足三里，每日1次，9次為一療程，療程間休息1天，共30日。中藥組：按25g/kg/日灌服中藥，30日。針?biāo)幗M：針刺操作同針刺組，同時(shí)灌服中藥，劑量同中

5、藥組，30日。對(duì)照組：三苯氧胺1.8mg/kg/日，相當(dāng)于臨床等效劑量，30日。正常組和模型組：灌服同體積蒸餾水，30日。標(biāo)本制備和檢測(cè)方法末次治療5小時(shí)后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量第2對(duì)乳房的直徑。斷頭取血，制備血清，置-70℃保存，用放免法測(cè)定血清E2、P和PRL含量，酶免法測(cè)定血清VEGF和bFGF含量。切取第2對(duì)乳房，甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化染色。美國(guó)IPP分析軟件對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行圖像分析，每個(gè)切片采集5個(gè)視野，得出度量物質(zhì)含量信息的灰度等級(jí)，將所得灰度值取平均數(shù)作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。平均灰度與陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)弱成反比，灰度值越小，陽(yáng)性染色越強(qiáng)，蛋白表達(dá)越多。統(tǒng)計(jì)方法所

6、有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，對(duì)所測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析檢驗(yàn)以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義動(dòng)物一般狀況正常組：大鼠毛色白而光澤，精神佳，反應(yīng)靈敏，飲食、二便正常，乳房大小正常，色淡紅，質(zhì)軟，用棉簽觸壓時(shí)大鼠無(wú)明顯的痛苦感。模型組：大鼠乳房乳頭增大，色鮮紅，質(zhì)硬，用棉簽觸壓時(shí)大鼠出現(xiàn)明顯的痛苦感，易激惹。結(jié)果大鼠乳頭直徑的變化大鼠血清生殖激素的變化血清VEGF的變化血清bFGF的變化乳腺組織VEGF、bFGF的表達(dá)VEGF、bFGF的陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi)，為棕黃色染色。與正常組相比，模型組大鼠乳腺組織中V

7、EGF、bFGF的表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.01）。治療后，針刺組、中藥組和針?biāo)幗MVEGF、bFGF的表達(dá)均明顯低于模型組（均P＜0.01）；對(duì)照組與模型組比較有降低的趨勢(shì)，但兩組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺組VEGF表達(dá)正常組VEGF表達(dá)模型組VEGF表達(dá)中藥組VEGF表達(dá)針?biāo)幗MVEGF表達(dá)對(duì)照組VEGF表達(dá)各組VEGF的表達(dá)正常組bFGF表達(dá)模型組bFGF表達(dá)中藥組bFGF表達(dá)各組bFGF表達(dá)針刺組bFGF表達(dá)針?biāo)幗MbFGF表達(dá)對(duì)照組bFGF表達(dá)討論乳腺增生大鼠模型的復(fù)制造模方法肌注外源性激素摘除雙側(cè)卵巢多數(shù)學(xué)者認(rèn)為