線粒體coi基因克隆

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1、線粒體COI基因的分子克隆一、試劑材料1、500一800克重的活鯉魚(yú)和1500一2500克重的活草魚(yú)各五條2、STE緩沖液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/LTris·HCI，1mmol/LEDTA，pH8.0)1L3、STM緩沖液(0.25mol/L蔗搪，10mMTris·HCl，0.5mmol/LMgcl2，PH8.0)50mL4、DNasel2mg5、0.5mol/LEDTApH8.010mL6、NTE緩沖液(20mmol/LNaCI，20mmol/LTris·HCI，lmmol/LEDTA，pH8.0)50mL7、20%SDS8、苯酚50ml9、

2、3mol/LNaAC(pH4.8)5mL10、冷乙醇(100%)50mL11、95%乙醇200Ml12、TE緩沖液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH8·0)，10mL13、10mg/mlDNA一freeRNaseA溶液（溶解RNaseA于TE緩沖液中，濃度為10mg/mL，煮沸10～30min,除去DNase活性，-20℃貯存）40ul14、氯仿:苯酚:異戊醇(Vl:V2:V3為24:24:l)49ml(24+24+1)1、引物1、引物22、10×PCR緩沖液（Buffer）3、2mMdNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、

3、dTTP各2mM4、Taq酶5、瓊脂糖：1.0%；6、電泳緩沖液（50×TAE電泳緩沖液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/LEDTA(pH8.0)20ml，加蒸餾水至100ml）7、溴化乙錠EB：5μl/100ml8、溴酚藍(lán)指示劑14、限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI、HindII、HindIII和Pstl，16、氨芐青霉素(100ug/ml)的LB平板（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水至1000ml,若配置固體培養(yǎng)基，則再加入15g?Agar(瓊脂)。）17、pUC19質(zhì)粒DNA19、桿菌HB101菌株，20、感受

4、態(tài)細(xì)胞HB101。二、工具材料1、剪刀5把不同大小2、鑷子5個(gè)不同大小3、燒杯2個(gè)大的4個(gè)小的4、移液管（一般用移液槍）5、離心管10個(gè)最大的6、培養(yǎng)皿5個(gè)小的10個(gè)大的7、三角錐瓶4個(gè)6、定容瓶2個(gè)50mL1個(gè)1L7、試管架1個(gè)三、設(shè)備材料1、高壓滅菌鍋2、無(wú)菌操作臺(tái)3、冰箱4、水浴鍋5、離心機(jī)6、玻璃勻漿器7、凝膠電泳系統(tǒng)8、紫外透射檢測(cè)儀9、PCR儀9、缺口轉(zhuǎn)譯標(biāo)記試劑盒，10、質(zhì)粒DNA限制酶消化分析及雜交探針系統(tǒng)11、硝酸纖維素濾膜13、同位素P32標(biāo)記的水稻線粒體Col探針紫外透射檢測(cè)儀四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）魚(yú)肝線粒體DNA的分離與純化1、按上面所寫(xiě)準(zhǔn)

5、備實(shí)驗(yàn)材料2、對(duì)實(shí)驗(yàn)器材滅菌3、對(duì)魚(yú)預(yù)處理刮鱗消毒取魚(yú)肝用STE緩沖液清洗4、再加入STE緩沖液到玻璃勻漿器里冰浴中緩和勻漿5、離心轉(zhuǎn)頭在3000g離心30分鐘6、除去上層脂肪和管底細(xì)胞碎片取上清液繼續(xù)離心20000g離心30分鐘得到粗提的線粒體沉淀。7、加入20mlSTM緩沖液2mgNasel25℃水浴中保溫消化30分鐘8、取0.8ml0.5mol/LEDTApH8.0溶液加到消化液中，使終濃度為20mmol/L，終止酶解反應(yīng)。9、然后再加入160mlSTE緩沖液，20000g下離心20分鐘，收集線粒體沉淀，重復(fù)用STE緩沖液漂洗線粒體二次，清除污染的核DN

6、A10、把離心所得的線粒體沉淀懸浮在20ml的NTE緩沖液，加入20%SDS溶液至終濃度為0.8%，放置在37℃水浴中保溫10分鐘。11、用等體積的苯酚抽提脫蛋白二次，留水相，12、用10分之1的3mol/LNaAC和二倍體積的冷乙醇(100%)，混勻后放在一20℃冰箱中沉淀過(guò)夜。13、離心收集mtDNA，真空干燥后溶于2.0ml的TE緩沖液,加入40ul(10mg/ml)的DNA一freeRNaseA溶液置37℃水浴中保溫60分鐘。14、消化液再用氯仿:苯酚:異戊醇抽提2一3次。水相加乙醇沉.淀DNA，并將離心收集的mtDNA經(jīng)真空干燥后，溶于適量的TE緩沖

7、液中，貯于—20℃冰箱備用。（二）線粒體COI基因的克隆1．PCR擴(kuò)增（1）在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。10×PCRbuffer5μldNTPmix（2mM）4μl引物1（10pM）2μl引物2（10pM）2μlTaq酶（2U/μl）1μlDNA模板（50ng-1μg/μl）1μl加ddH2O至50μl視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油（防止PCR過(guò)程中蒸發(fā)）。（2）調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃變性40s→58℃退火30s→72℃延伸

8、60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃