資源描述：
《人骨肉瘤差異表達(dá)基因的篩選》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、人骨肉瘤差異表達(dá)基因的篩選摘要:目的研究人骨肉瘤組織與正常骨組織之間的差異表達(dá)基因，探討骨肉瘤的基因改變，為建立骨肉瘤的基因診斷方法打下基礎(chǔ).方法采用mRNA差異展示技術(shù)，應(yīng)用3條錨定引物和8條隨機(jī)引物從人骨肉瘤組織與正常骨組織中分離出差異表達(dá)基因，對(duì)其進(jìn)行克隆、測(cè)序，用打點(diǎn)雜交技術(shù)證實(shí)其是否為差異表達(dá)基因，將篩選出的差異表達(dá)基因在GenBank檢索進(jìn)行序列同源性分析.結(jié)果篩選及克隆出6條差異條帶，為ZOL03，ZOL51，1C82，1C74，2A21及2G12，RNA打點(diǎn)雜交證實(shí)它們?cè)诠侨饬鲋斜磉_(dá)，在正常骨組織中不表
2、達(dá).6條差異片段經(jīng)序列測(cè)定，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列相似性分析，證實(shí)ZOL03，ZOL51同源性極低;1C82，1C74，2A21，2G12同源性較低，此6條片段為新基因序列，ORFfinder分析未發(fā)現(xiàn)具有開(kāi)放讀框，均屬于非編碼區(qū)序列.其中ZOL03和ZOL51兩個(gè)序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄，接受號(hào)為BI894276和BI936370.結(jié)論分離并克隆了人骨肉瘤組織與正常骨組織之間的6條差異表達(dá)基因，同源性差，均確認(rèn)為新基因，可能是骨肉瘤差異表達(dá)相關(guān)基因. Keyanosteosaratissueand
3、normalbonetissueandtodiscussthealterationofgenesinosteosara.METHODSByRNAdifferentialdisplayPCR，us-ing3anchorprimersand8stochasticprimers，differentiallyexpressedgenesbetanosteosaratissueandnor-malbonetissuealbonetissue.SequencingandsearchinginGenBankforparability
4、foundthatthe6sequencesilartosequencesinGenBank.6sequencesbersanosteosaraandnormalbonetissuesanosteosara. 0引言 骨肉瘤是骨科最常見(jiàn)的高度惡性腫瘤.只有找到骨肉瘤特異性基因（差異表達(dá)基因）才有可能建立高度敏感且準(zhǔn)確的基因診斷方法.因此，能否找到與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的差異表達(dá)基因已成為制約研究骨肉瘤治療及早期診斷的關(guān)鍵因素.我們采用差異展示PCR（DD-PCR）技術(shù)研究人骨肉瘤組織與正常骨組織之間的差異表達(dá)基因
5、，探討骨肉瘤的基因改變，為建立骨肉瘤的基因診斷方法打下基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1材料唐都醫(yī)院全軍骨腫瘤研究所確診、未經(jīng)任何治療且無(wú)法保肢的骨肉瘤患者之截肢標(biāo)本，選取骨肉瘤組織及相同肢體的正常骨組織.差示PCR引物采用GenHunter公司Liang和Pardee1996-04提供的第三代序列，由上海生物工程公司合成，5′端引物為8條，3′端引物為3條，其序列為:H-AP1:5′-AAGCTTGATTGCC-3′;H-AP 2:5′-AAGCTTCGACTGT-3′;H-AP 3:5′-AAGCTTT-GCTCAG
6、-3′;H-AP 4:5′-AAGCTTCTCAACG-3′;H-AP 5:5′-AAGCTTAGTAGGC-3′;H-AP 6:5′-AAGCTTGCACCAT-3′;H-AP 7:5′-AAGCTTAA-CGAGG-3′;H-AP 8:5′-AAGCTTTTACCGC-3′;H-T 11G:5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′;H-T 11A:5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′;H-T 11C:5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′.JM109為本所保存，pGEM○R-T載體購(gòu)自Promeg
7、a公司.無(wú)RNA的DNA酶Ⅰ，SalⅠ和SphⅠ購(gòu)自TaKaLa公司;Su-perscriptTMⅡRNaseH-反轉(zhuǎn)錄酶及DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自Gibco公司;α-32PdATP及г-32PdATP購(gòu)自北京亞輝生物工程公司. 1.2方法取新鮮截肢標(biāo)本，無(wú)菌條件下，即取截肢體正常骨段骨組織，剔除骨膜，除凈松質(zhì)骨和骨髓，將此皮質(zhì)骨咬至0.5cm×0.5cm大小，以4℃生理鹽水反復(fù)沖洗后，迅速置液氮中保存.將保存的骨組織取出置室溫下3～5min，再放回液氮中，反復(fù)凍融5～8次.取此凍融骨組織約200mg浸入裝有2mL預(yù)
8、冷變性液的離心管中，冰浴下以高速離散器快速粉碎、勻漿，以備提取總RNA［2］.參照奧斯伯標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法抽提正常骨組織和骨肉瘤組織勻漿液中總RNA［1］，用無(wú)RNA的DNA酶Ⅰ處理后以DEPC處理水溶解，紫外分光光度儀測(cè)定總RNA吸光度（A260nm，A280nm），變性瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性.mRNA差異顯示按GenHu
