資源描述：
《差異表達(dá)基因的幾種篩選方法論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、差異表達(dá)基因的幾種篩選方法論文【關(guān)鍵詞】mRNA差異顯示；基因表達(dá)；DNA微陣列【摘要】多種因素導(dǎo)致的基因差異性表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展密切有關(guān)，分離差異表達(dá)基因，對(duì)于研究細(xì)胞生命過程的調(diào)節(jié)機(jī)制及致病機(jī)制具有重要意義.20世紀(jì)90年代以來，先后出現(xiàn)了mRNA差異顯示PCR（mRNADDRTPCR）、代表性差異分析（RDA）、抑制性消減雜交（SSH）、基因表達(dá)連續(xù)性分析（SAGE）和DNA微陣列（DNAmicroarray）等多種分析差別表達(dá)基因的方法.我們對(duì)以上方法的原理、基本步驟及其應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述.【關(guān)鍵詞】mR
2、NA差異顯示；基因表達(dá)；DNA微陣列0引言隨著各類基因組計(jì)劃的相繼完成，人類面臨的更艱巨的任務(wù)是研究基因功能活動(dòng)，也就是說基因組序列分析僅僅代表了遺傳信息復(fù)雜性的一個(gè)層次，而遺傳信息有序地、時(shí)相地表達(dá)則是決定生物體及其行為的另一個(gè)層次.所以，發(fā)現(xiàn)不同生物體及其組織在各種狀態(tài)下（正常狀態(tài)、發(fā)育、衰老、損傷及疾?。┎町惐磉_(dá)的基因具有十分重要的意義.freelRNA的豐度高低及有無進(jìn)行比較.差異表達(dá)基因有兩個(gè)含義，即表達(dá)基因的種類變化和基因表達(dá)量的變化.傳統(tǒng)的基因分析方法如Northern雜交、斑點(diǎn)雜交等存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力
3、的缺點(diǎn)，已不適宜進(jìn)行大規(guī)?；虮磉_(dá)分析研究的需要.因此隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了大量新方法，按其技術(shù)特點(diǎn)可分為三類：①以雜交為基礎(chǔ)的技術(shù)，包括Northernblotting，Slmapping/Rnase保護(hù)、抑制性消減雜交和DNA微陣列；②以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，如差異顯示PCR（DDPCR）、代表性差異分析（RDA）；③以測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的技術(shù)，如表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）、基因表達(dá)連續(xù)性分析（SAGE）等.我們對(duì)目前主要的差異表達(dá)基因的篩選方法作一綜述.1mRNA差異顯示PCR(differentialdispla
4、yPCR，DDPCR)mRNA差異顯示PCR又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（differentialdisplayreversetranscriptionPCR,DDRTPCR）.DDRTPCR技術(shù)［1-3］最早于1992年出現(xiàn)，可以用于分離在不同的真核細(xì)胞中差異表達(dá)的cDNA并加以克隆.其原理是將兩種細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR3′端引物序列是針對(duì)mRNA的poly(A)尾設(shè)計(jì)的，一般是11個(gè)T再加上兩個(gè)堿基，這樣12種3′端引物(T11AA，T11AC,T11AG，T11AT，T11CA，T11G
5、A，T11CC，T11CG，T11CT，T11GC，T11GG，TT11GT)就可以與所有mRNA的poly(A)尾匹配；5′端引物是隨機(jī)引物，一般為10個(gè)堿基，因此產(chǎn)生一些不同長(zhǎng)度的cDNA片段，電泳后比較兩者的差別而得到差異表達(dá)基因的cDNA.但這個(gè)方法存在許多嚴(yán)重的缺陷，它的5′端隨機(jī)引物一般常有2～3個(gè)堿基不能與cDNA模板完全匹配，而且PCR反應(yīng)中隨機(jī)性、偶然性比較大，容易形成非特異性擴(kuò)增而造成高的假陽性率，這就使下游的篩選工作很巨大.理論上此方法可以檢測(cè)到95％以上的轉(zhuǎn)錄體，但由于引物序列的隨機(jī)性和競(jìng)
6、爭(zhēng)性模板結(jié)合位點(diǎn)的存在，很難確定實(shí)際的原始RNA豐度.盡管有上述缺陷，但由于其實(shí)驗(yàn)步驟較簡(jiǎn)單，此方法在實(shí)際工作中應(yīng)用仍較多，例如用于篩選在腫瘤發(fā)生、愈傷過程以及胚胎植入過程中起重要作用的基因等.2代表性差異分析(representationaldifferenceanalysis，RDA)RDA［4-8］是Lisitsyn等于l993年在差減雜交的技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展的分析基因組DNA差異的方法，Hubank等于l994年對(duì)其作改良后用于cDNA的分析.該技術(shù)是將差減雜交與PCR有機(jī)結(jié)合形成的一種方法［9］,主要步驟包
7、括:①將對(duì)照組（driver)和待測(cè)組(tester)mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段群，接上接頭進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增；②將testercDNA和drivercDNA用限制性內(nèi)切酶酶切，形成平均長(zhǎng)度256bp的cDNA；③將接頭消化,在testercDNA末端接上新的接頭，testercDNA和drivercDNA按1∶100比例混合.過量的divercDNA可與testercDNA中互補(bǔ)的部分形成雙鏈；④復(fù)性，以新接頭為引物進(jìn)行第2輪PCR.三種雜合體中只有自身退火形成的tester/tester雜合體才能和引物配
8、對(duì),并以指數(shù)形式擴(kuò)增；tester/driver雜合體只能是線性遞增；而driver/driver雜合體則無法擴(kuò)增.該方法的主要優(yōu)點(diǎn)就是能夠使差異表達(dá)的基因高度富集，重復(fù)性較好，假陽性少.利用RDA人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新基因.如白血病凋亡相關(guān)基因TFAR19，人乳腺癌相關(guān)基因TSPS0等.Arava等［10］利用RDA分析了胰腺β細(xì)胞和α細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)26個(gè)基因在β細(xì)胞中高表達(dá)
