畢赤酵母研究動向

《畢赤酵母研究動向》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、張伍魁*范清林宋禮華(安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院合肥230032)摘要巴斯得畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)作為一個日臻完善的外源蛋白真核表達系統(tǒng)由于它所具有的一些其它表達系統(tǒng)不可比擬的優(yōu)勢而得到越來越廣泛的應(yīng)用。分別從該表達系統(tǒng)的優(yōu)點、外源基因整合及調(diào)控機理、表達蛋白糖基化及翻譯后修飾等方而綜述了其在外源蛋0表達中的研宄進展及應(yīng)用。關(guān)鍵詞巴斯得畢赤酵母外源基因糖基化中圖分類號Q786巴斯得畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)是上世紀80年代初期發(fā)展起來的一種新型的外源蛋Q表達系統(tǒng)［1］，它既具有原核表達系統(tǒng)操

2、作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達量高、成本低等優(yōu)點，還具有原核生物表達系統(tǒng)所不具有的對外源蛋Q的翻譯后修飾等特點，如糖基化、蛋0磷酸化等。同時它還避免丫釀酒酵母(Saccharomyccsccrcvisiac)分泌效率差、表達菌株不夠穩(wěn)定、表達質(zhì)粒易丟失等缺陷［2］。除此之外，由于它在蛋白質(zhì)表達方面還具有以下幾個其它表達系統(tǒng)所不可比擬的優(yōu)點而使得該系統(tǒng)成為目前研究最多、應(yīng)用最廣泛的真核表達系統(tǒng)之一：(1)它所具有的aox啟動子是一種強有力的啟動子，受甲醇嚴格誘導(dǎo)調(diào)控而表達，所以可嚴格調(diào)控外源蛋白的表達；(2)由于它可以對表達蛋Q進行

3、糖棊化、蛋0磷酸化、折疊、信號序列加工、脂類?；纫幌盗械姆g后修飾，從而使其表達的蛋Q具有生物活性；(3)表達量高，迄今為止，已有300多種異源蛋Q在該表達系統(tǒng)屮獲得丫高效表達，如破傷風(fēng)毒素片段C可達12g/L［3］，而明膠的表達量甚至達到了14.8g/L［4］，已有報道其胞

4、Aj表達量驚人，甚至達到了22g/L;(4)外源棊因的表達產(chǎn)物既可存在于胞

5、Aj，又可通過其特有的信號肽a因子或天然蛋Q本身的信號肽分泌至細胞外，同時，該系統(tǒng)自身分泌的蛋白非常少，這大大簡化丫純化過程，如表達的重組水蛭素(11IR)，僅經(jīng)過二步層析純化就可達到

6、97%以上的純度；(5)整合入外源棊因的重組子表達系統(tǒng)十分穩(wěn)定。有文獻報道通過同源重組整合入外源棊因的重組子表達系統(tǒng)可連續(xù)培養(yǎng)50代卻未見外源棊因丟失的現(xiàn)象［5］;(6)糖棊化程度低，畢赤酵母屮加到外源蛋Q每條側(cè)鏈的平均長度為8~14個甘露糖殘棊，較之釀酒酵母每條側(cè)鏈平均5CT150甘露糖殘棊要短得多［6］，同時，由于畢赤酵母不能象釀酒酵母那樣在核心多糖末端形成a1,3末端甘露糖，使得它的蛋0抗原性遠遠低于后者。因而更適合于治療用途［7］;(7)該表達系統(tǒng)由于對營養(yǎng)要求低，培養(yǎng)基成份簡單廉價，可進行高密度高產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)，便于工業(yè)化生

7、產(chǎn)。1常用表達菌株及表達載體1.1表達菌株P(guān).pastoris作為一種甲醇利用型酵母菌，自1969年開發(fā)以來，通過數(shù)十年的研宂，至今已有多個種屬被開發(fā)出來，新近發(fā)展起來的嗜甲醇酵母包括Candida和Pichia2個種屬，共有30余種［8］，其中尤以P.pastoris發(fā)展最快，研宄最清楚。目前，用于外源基因表達的P.pastoris菌株為Invitrogen公司構(gòu)建，主要有：Y11430,MG1003,GS115,KM71和SMD1168,其中Y11430為野生型，其余皆為組氨酸突變型，GS115有完整的aoxl基因，在甲醇培養(yǎng)基上

8、表型為Mut+,當(dāng)用重組表達載體轉(zhuǎn)化后，由于表達載體線化所用酶不同，其轉(zhuǎn)化子表型可能是Mut+或luts，可通過MD和麗培養(yǎng)基進行表型的鑒定;KM71的aoxl基因被ARG4基因替代，雖然aox2和aoxl有97%同源性，但aox2利用甲醇的能力遠比aoxl弱［9］，在甲醇培養(yǎng)基上表現(xiàn)為Muts，其轉(zhuǎn)化子也是Muts，表型不必鑒定。SMD1168為蛋白酶缺陷型菌株，特別適用于分泌表達載體，可避免表達外源蛋0被宿主菌同時表達的蛋0酶所降解，其它蛋0酶缺陷型主要還有SMD1165和SMD1163［10］。MCI003的aox基因全部刪除

9、，不能利用甲醇，即表型為Mut—His—。1.2表達載體P.pastoris沒有穩(wěn)定的附加體質(zhì)粒，所以一般用整合型載體作為外源基因的表達載體，目前常用的喪達載體多是美國Invitrogen公司開發(fā)構(gòu)建的。P.pastoris既有分泌表達型的，又有胞內(nèi)表達型的。常用的表達載體主要有：pPIC9,pPIC9K,pHILS,pA0815,pHILD2和pPICz等，其中pPIC9,pPIC9K和pHILS為分泌型表達載體，而pA0815,pHILD2和pPICz為胞內(nèi)型表達載體，不同載體除具有各自特殊的基因組件外，還具有一些共同的序列，如這

10、些載體都包括一個表達盒（cassette）和一個多克隆位點。表達盒由900bp的5'aoxl序列和約300bp的3Z轉(zhuǎn)錄終止序列組成［9］,用特昇的酶切割多克隆位點可以使目的基因插入到相應(yīng)的酶切位點中。多數(shù)P.pasto