重組鞭毛蛋白cblb502的研制及其在預(yù)防免疫性肝損傷中的應(yīng)用研究

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1、ＴｌＡＭＪＩＭＵＩＶＥＲＳＩＴＹ中國第－所現(xiàn)代大學(xué)ＭＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博學(xué)位文￥ｆ一級學(xué)科化學(xué)工程與技術(shù)：學(xué)科專業(yè)：制藥工程作者姓名王晶：楊曉明教授指導(dǎo)教師：天津大學(xué)研究生院２０１７年５月重組鞭毛蛋白CBLB502的研制及其在預(yù)防免疫性肝損傷中的應(yīng)用研究ThedevelopmentofrecombinantFlagellinCBLB502anditsapplicationstudiesinpreventingimmune-mediatedliverinjury一級學(xué)科：化學(xué)工

2、程與技術(shù)學(xué)科專業(yè)：制藥工程研究生：王磊指導(dǎo)教師：楊曉明教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一七年五月摘要肝臟是一個天然免疫器官，獨(dú)特的雙重供血系統(tǒng)使其經(jīng)常暴露在包括TLRs配體分子（如細(xì)菌脂肽/脂蛋白、雙鏈RNA、LPS、Flagellin等）在內(nèi)的多種腸道微生物組分之中，而TLRs介導(dǎo)的信號通路廣泛參與了肝臟炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展。作為唯一一個配體為蛋白質(zhì)的模式識別受體，TLR5信號通路的活化對電離輻射、化療藥物、氧化應(yīng)激、移植物抗宿主反應(yīng)等導(dǎo)致的組織和器官損傷均具有明顯的防護(hù)作用，而關(guān)于TLR5信號通路與肝臟炎性疾病的關(guān)系則鮮有報(bào)道。本研究

3、制備了一種人為改構(gòu)的新型TLR5激動劑CBLB502，評價(jià)了其介導(dǎo)的免疫調(diào)控機(jī)制對刀豆蛋白A（ConcanavalinA）誘導(dǎo)的免疫性肝損傷的防治效果，取得的研究結(jié)果如下：本文在前期實(shí)驗(yàn)室研究工作的基礎(chǔ)上，建立了DEAE陰離子交換層析制備CBLB502蛋白的中試發(fā)酵和純化工藝，每批濕菌量在200～240克時，可獲得總量約2克、純度不低于95%的CBLB502蛋白；根據(jù)《中國藥典》相關(guān)要求，對連續(xù)三批次制備的CBLB502蛋白原液進(jìn)行了理化性質(zhì)、蛋白含量和純度、生物學(xué)活性以及相關(guān)物質(zhì)殘留等測定，并進(jìn)行了方法學(xué)研究；確認(rèn)所制備的CBL

4、B502蛋白各項(xiàng)指標(biāo)符合《中國藥典》中關(guān)于重組蛋白藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求并在此基礎(chǔ)上擬定了CBLB502蛋白原液的制造和檢定標(biāo)準(zhǔn)；通過非人靈長類動物獼猴重度骨髓型急性放射病模型，驗(yàn)證了CBLB502蛋白的輻射防護(hù)藥效。檢測了44例正常人血清樣本中CBLB502中和性抗體的水平，初步確定了臨床試驗(yàn)入選者中和性抗體水平閾值；制備了用于臨床藥代動力學(xué)用CBLB502特異性單克隆抗體。通過ConA誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型，首次發(fā)現(xiàn)了CBLB502對免疫因素導(dǎo)致的肝臟損傷具有顯著的防治效果。CBLB502預(yù)防給藥可以明顯提高動物的生存質(zhì)量；顯著

5、抑制ConA導(dǎo)致的肝臟組織凋亡和壞死；抑制轉(zhuǎn)氨酶和炎性因子水平上升；抑制炎性免疫細(xì)胞的活化和浸潤。機(jī)制研究結(jié)果表明，在ConA肝損傷模型中，CBLB502能夠負(fù)性調(diào)控T/NKT細(xì)胞活性并抑制其產(chǎn)生IL-4、TNF-α和IFN-γ等炎性細(xì)胞因子，而且對α-Galcer誘導(dǎo)的NKT細(xì)胞依賴性的肝損傷表現(xiàn)出類似的抑制效應(yīng)；應(yīng)用骨髓嵌合小鼠模型，發(fā)現(xiàn)骨髓來源的免疫細(xì)胞而非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)了CBLB502的肝保護(hù)效應(yīng)；CBLB502誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-6可能對其抑炎藥效的發(fā)揮至關(guān)重要，表現(xiàn)為內(nèi)源性的IL-6被中和后CBLB502的肝保護(hù)作用明顯減

6、弱。應(yīng)用tlr5基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性TLR5信號通路缺失會導(dǎo)致小鼠對ConA的敏感性增強(qiáng)，表現(xiàn)為動物生存質(zhì)量下降；肝臟組織炎性壞死增加；血清炎性因子水平上升以及炎性免疫細(xì)胞的活化和浸潤增多。以上結(jié)果表明CBLB502介導(dǎo)的免疫調(diào)控機(jī)制對抑制T細(xì)胞活化誘導(dǎo)的肝損傷效果顯著，具有在臨床上防治肝臟炎性疾病的應(yīng)用潛力。關(guān)鍵詞：鞭毛蛋白Toll樣受體5免疫性肝損傷T細(xì)胞ABSTRACTLiverisaninnateimmuneorganwhichsharesauniquedualbloodsupplyingsystem,therefor

7、e,itwasanatomicallyexposedtovariouskindsofgutbacterialcomponentsincludingTLRsligands(e.g.bacteriallipopeptide/lipoprotein,dsRNA,LPS,andFlagellin)anditisreportedthatTLRs-mediatedsignalingwasextensivelyimplicatedintheonsetandprogressionofinflammatoryliverdiseases.Astheo

8、nlyknownTLRthatsenseaproteinligand,TLR5activationexertedfabulousprotectiveefficacyagainstion-radiation,chemotherapeuticdrugs