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1、第一章文獻綜述方法。Dedryver等(1996)【1321已經(jīng)成功地將小麥銹病基因Lr24的RAPD標記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標記。1．2．1．2．3小衛(wèi)星DNA小衛(wèi)星DNA是1980-1984年間由人類遺傳學家相繼在人體基因組中發(fā)現(xiàn)的。它是由長度為10—60bp的核心序列串聯(lián)重復形成的可達25Kb的串聯(lián)重復序列，可遍布于基因組的很多位點(E1yet．a(chǎn)l，1991)【””。人類基因組中包含高達30％的重復DNA序列，其它真核生物亦如此。小衛(wèi)星DNA在真核基因組中具有多等位性、高豐富性和極強的保守性，在不同個體之間存在有串聯(lián)數(shù)目的差異，這種多態(tài)性可能是在DNA復制或不等交換過程中
2、發(fā)生的(Jeffreys，1985)【13“。以重復序列的核心序列為探針，與基因組的限制酶譜進行雜交，從而得到該物種的DNA指紋圖譜。因其含豐富的多態(tài)信息，選擇合適的限制酶類和探針，便可得到具有個體特異性的指紋圖譜。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了～些十分有用的小衛(wèi)星探針。Wassart等(1992)[z47l在小麥基因組文庫中篩選到了一個4．ikb的DNA克隆pTa9546，用該克隆作探針能夠檢測到小麥lo條染色體上12個位點的等位變異區(qū)分出參試的56個普通小麥品種，是繪制小麥指紋圖譜非常有用的探針。1．2．1．2．4微衛(wèi)星DNA(又稱simplesequencerepeats，簡稱SSR)在人
3、類及動植物的基因組中，均存在著許多由1-5個堿基對組成的簡單重復序列，如(GA)。、(AC)。(GAA)。等。同一類的微衛(wèi)星可分布于整個基因組的不同位置上，每個座位上重復單位的數(shù)目及至重復單位的序列都可能不完全相同，因而造成了每個座位上的多態(tài)性。與RFLP標記相比，SSR檢測的多態(tài)性頻率要高很多：Gregan(1994)1194]在96份大豆資源中，發(fā)現(xiàn)了多達29個SSR等位變異，而通常用RFLP僅能發(fā)現(xiàn)2—3個等位變異。可見SSR標記的多態(tài)性信息含量是較高的。由于每個微衛(wèi)星DNA兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列，因而可根據(jù)其兩端的序列設計一對特異引物，通過擴增而產(chǎn)生多態(tài)性。1
4、．2．1．2．5AFLPAFLP技術(shù)是1992年荷蘭Zabeau等人?91發(fā)明的一項技術(shù)。其基本原理是選擇性擴增基因組DNA的酶切片段，由于不同材料的DNA酶切片段存在差異，因而便產(chǎn)生了擴增產(chǎn)物的多態(tài)性。選擇性擴增是通過在引物3’端加上選擇性核苷酸而這現(xiàn)的，改變選擇性核苷酸的數(shù)目，就可以預先決定所要擴增的片段的數(shù)目?？梢夾FLP實際上是RFLP著NPCR相結(jié)合的一種方法，它結(jié)合了RFLP穩(wěn)定性PCR技術(shù)高效性的特點。AFLP可以分析基因組較大的作物，其多態(tài)性很強，利用放射性標記在變性的聚丙烯酰胺凝膠上可檢測到100-150個擴增產(chǎn)物，因而非常適合繪制品種的指紋圖譜及進行分類研究。
5、Dedryver等
6、1321利用14份水稻材料比較AFLP和RAPD的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RAPD方法21個引物獲得103條擴增帶，43個標記，而AFLP方法18個引物獲得了529條帶，147個標記。AFLP雖產(chǎn)生不久卻倍受青睞，己應用于水稻(Mackill，1996，Choet．a(chǎn)l，1996；Maheswaranet．a(chǎn)l，1997)[138,131,I39]、大豆(Keimet．a(chǎn)1，1997)11741、大麥(Qix，1997)[187]、土豆(Bachemet．a(chǎn)l，1996)[t30]等多種作物上，所有研究表明AFLP產(chǎn)生的多態(tài)性遠遠超6陜油8號種子純度的鑒定研究過RFLP
7、、RAPD等技術(shù)，因而被認為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最豐富的一項技術(shù)，可應用于一般分子標記技術(shù)的所有應用范圍(張修軍，1999)U7]。但該技術(shù)的缺點是需要同位索檢測，同時成本也較高，另外AFLP已申請專利，人們可以自由利用該項技術(shù)用于非贏利性的科學研究，但生產(chǎn)及商業(yè)上的應用受到限制。近來用銀染法代替同位索法檢測擴增產(chǎn)物，取得較好的效果，不僅降低實驗成本，縮短試驗周期，而且提高了AFLP技術(shù)的實用性(張峰，[999)【l”。除上述五種DNA指紋圖譜技術(shù)外，Zhu等(1995)[1501發(fā)明了新的繪SUDNA指紋圖譜的方法，稱為隨機末端引物重復序列間擴增(randomendprime
8、ramplificationofinterspersedrepeats，簡稱REPAIR)。用該方法，僅需2-3個引物就可鑒別出50個水稻品種的大多數(shù)，并能識別其中三個人為設置的重復。現(xiàn)代分子標記技術(shù)發(fā)展非常迅速，隨時都會有新的標記技術(shù)被發(fā)明、被利用。密切注視這方面的發(fā)展動向，就能不斷以新的、先進的分子標記技術(shù)豐富DNA指紋圖譜技術(shù)。CAPS法可靠檢測某等位基因中，因～個堿基突變而產(chǎn)生的獨特的限制酶切位點，但通常單個堿基的突變大多數(shù)不能創(chuàng)造這樣的酶切位點，而限制了其使用。隨著高通
