淺談?wù)摴鹬蜍咄鑼闪鍪竽[瘤細胞凋亡的影響

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1、淺談?wù)摴鹬蜍咄鑼闪鍪竽[瘤細胞凋亡的影響　　論文：桂枝茯苓丸；凋亡；SurvivinmRNA　　論文：目的：探索桂枝茯苓丸誘導腫瘤細胞凋亡機制，為桂枝茯苓丸(GFPUS顯微鏡(日本)、HITACHI－H500型透射電鏡(德國菲利蒲公司)、FACSCALIBUR流式細胞儀(美國BD公司)、SB651旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本RIKAKI公司)、HIMAS－2000多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)(同濟醫(yī)大)?！　?．2　實驗動物　40只昆明小鼠，體重(20±2)g，雄性，由齊齊哈爾醫(yī)學院實驗動物中心提供?！　?．3　瘤株S180瘤株，由黑

2、龍江省腫瘤探究所提供　　1．4　藥物　桂枝茯苓丸：按《金匱要略》記載標準，生藥均購自齊齊哈爾市中醫(yī)院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各藥等量，加適量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮2次，經(jīng)過濾除渣后，水浴濃縮，配成1g/mL的水煎劑，置4℃保存?zhèn)溆谩！　…h(huán)磷酰胺(Cylophosphamide，CY)，山西普德藥業(yè)有限公司出品，批號H14023686?！　?．5　動物模型　取腹腔接種10天的荷瘤小鼠，在無菌條件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放進無菌容器內(nèi)，置冰塊保存。用0.4％臺盼藍生理鹽水液計數(shù)(計活細胞大于95％)，用生理

3、鹽水調(diào)細胞濃度至5×106/mL。取KM小鼠30只，每只鼠右側(cè)腋下皮下注射0.2mL瘤細胞懸液?！　?．6　動物分組及給藥方法　將荷瘤鼠隨機分為3組，每組10只，分別為模型組、實驗組、CY組，另取10只未荷瘤小鼠作為正常對照。模型組(Modelgroup)：生理鹽水灌胃0.2mL/(10g·d)；中藥組(GFL/(10g·d)；環(huán)磷酰胺組(CYgroup)：腹腔注射CY20mg/(kg·d)。接種后越日給藥，各組天天給藥1次，連續(xù)10天?！　?．7　細胞凋亡的檢測(流式細胞儀－單激光單染色法)小鼠脫頸正法，無菌取腋下實體瘤

4、，常規(guī)制備瘤細胞懸液，調(diào)整濃度1×106/mL，1500r/min離心5min，棄上清，PBS洗1次，加70％冷乙醇1mL,4℃固定30min。離心5min，棄上清，PBS洗2次。加50mg/mLPI染液600mL染色，30min后上機測定?！　?．8　透射電鏡觀察形態(tài)學改變　每組隨機取2塊瘤組織，將瘤組織快速投進2.5％戊二醛固定液固定2h以上，磷酸緩沖液漂洗，1％鋨酸后固定1－2h，緩沖液漂洗20min，丙酮梯度脫水，浸透、包埋、制備超薄切片，醛酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，電鏡觀察并拍片?！　?．9　原位雜交瘤組織及時固定

5、，切片常規(guī)脫蠟至水。3％H2O2室溫封閉10min，PBS洗，暴露mRNA核酸片斷，滴加預雜交液20μL，40℃3h，不洗，Survivin探針雜交液20μL，滴加40℃雜交過夜，雜交后洗滌，滴加生物素化抗地高辛37℃60min，原位雜交用PBS洗5min×4次，滴加高敏過氧化物酶鏈親和索復合物工作液，37℃60min，原位雜交用PBS洗5min×4次，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。本實驗設(shè)2張陰性對照片，1張用PBS代替探針，1張用PBS代替生物素化抗地高辛。　　1．10　統(tǒng)計方法　Su

6、rvivin結(jié)果利用HIMAS－2000多媒體全自動圖像分析儀檢測，所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS11.0系統(tǒng)處理，采用OneAS－2000多媒體圖像分析系統(tǒng)對Survivin各組原位雜交反應(yīng)陽性細胞面密度值、陽性細胞均勻灰度值進行分析。和模型組比較，GFRNA表達降低(P＜0.01)，GFRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示GFRNA量?！　　　?　討　論　　通過應(yīng)用各種不同的藥物影響信號傳導途徑，從而觸發(fā)或重建整個死亡程序，使處于封閉狀態(tài)的凋亡信號傳導各效應(yīng)環(huán)節(jié)迅速連通，誘導程序化細胞死亡反應(yīng)，為腫瘤治療開辟了新思路。

7、細胞凋亡信號傳導的大致過程是：細胞整合各種胞內(nèi)外凋亡信號，通過細胞凋亡信號和其受體形成的復合物經(jīng)胞漿信號轉(zhuǎn)導蛋白傳遞至一組細胞凋亡的執(zhí)行者caspases，再由激活的easpases對其特異性底物進行降解，終極導致細胞凋亡。本實驗經(jīng)流式細胞儀檢測表明，GFRNA，結(jié)果顯示SurvivinmRNA在模型組中高表達，表明在腫瘤細胞中該基因轉(zhuǎn)錄功能增強，基因蛋白天生后，通過破壞凋亡平衡參和腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展。和模型組比較，GFRNA表達降低(P＜0.01)，表明GFPoNA的轉(zhuǎn)錄水平的功能，提示桂枝茯苓丸可通過影響Survivin

8、表達促進腫瘤細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長?！　【C上所述表明GFW具有誘導腫瘤細胞凋亡功能，其分子機制和Survivin表達有關(guān)。而腫瘤是多基因異常所致疾病，桂枝茯苓丸抑制腫瘤生長在基因水平的功能是對上述基因特異的功能，或是對多種癌基因和抑癌基因非特異功能有待進一步探究。