益腎活血提取液對oxldl誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cd40、mmp

《益腎活血提取液對oxldl誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cd40、mmp》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、益腎活血提取液對oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CD40、MMP：劉桂林1張繼東竇迎春2王博任敏喬云【摘要】目的觀察益腎活血提取液對氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)CD40、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)表達(dá)的影響。方法原代培養(yǎng)HUVECs，取3~5代細(xì)胞用于試驗(yàn)，提取細(xì)胞RNA及蛋白。采用實(shí)時定量RT-PCR檢測HUVECsVCAM-1mRNA表達(dá)，采用MP-9的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果刺激組CD40、MMP-9及VCAM-1的表達(dá)較空白組明顯升高(1.48±0.34vs0

2、.45±0.16;1.54±0.16vs0.62±0.12，12.82±0.16vs1.00±0.01,P均<0.001)，大、中、小劑量的益腎活血提取液可以不同程度地抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUVECs、CD40、MMP-9及VCAM-1的高表達(dá)。結(jié)論益腎活血提取液具有改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用，其機(jī)制與抑制oxLDL誘導(dǎo)的HUVECsCD40、MMP-9及VCAM-1的高表達(dá)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】益腎活血提取液;氧化型低密度脂蛋白;白細(xì)胞分化抗原;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;血管細(xì)胞黏附分子-1　目前認(rèn)為動脈粥樣硬化(AS)是一多因素、多基因引起的復(fù)雜的慢性

3、炎癥性疾病。氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的內(nèi)皮損傷與激活參與了AS的形成。白細(xì)胞分化抗原40(CD40)與CD40配體的相互作用參與了AS斑塊的形成與破裂，在斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)過程中起重要作用〔1~3〕。血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)通過與配體相互作用參與T細(xì)胞-T細(xì)胞、T細(xì)胞-基質(zhì)殺傷細(xì)胞-靶細(xì)胞之間的相互作用,與AS過程中炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)〔4〕?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)可降解血管壁的膠原纖維，彈力蛋白，玻璃體結(jié)合蛋白等，促進(jìn)斑塊的形成、不穩(wěn)定與破裂。益腎活血提取液以益腎活血為組方原則，佐以化痰祛瘀，臨床研究證實(shí)其有降低冠

4、心病患者血清內(nèi)皮素、腫瘤壞死因子α水平，升高一氧化氮水平的作用〔5〕,為進(jìn)一步闡　明其抗AS作用的機(jī)制，本研究觀察了益腎活血提取液對oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)CD40，MMP-9及VCAM-1表達(dá)的影響?！　?材料與方法　　1.1主要試劑M199干粉培養(yǎng)基，美國Gibco公司生產(chǎn)。胎牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司。胰蛋白酶，美國Sigma公司生產(chǎn)。重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子外用溶液(貝復(fù)濟(jì))，珠海億勝生物制藥有限公司。4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。oxLDL,廣州中山大學(xué)提供。兔抗

5、小鼠/人CD40多克隆抗體，兔抗小鼠/人MMP-9多克隆抗體，兔抗人/小鼠CD31單克隆抗體，均為英國Abcam公司產(chǎn)品。兔抗人/小鼠/大鼠β-actin多克隆抗體，美國SantaCruz公司產(chǎn)品。山羊抗兔IgG二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Trizol，美國Invitrogen公司生產(chǎn)。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRPremixExTaqTMDRR041S試劑盒，TaKaRa大連寶生物工程有限公司。DNAMarker，北京天根生化公司產(chǎn)品。蛋白裂解液(RIPA)和二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。脫脂

6、奶粉，黑龍江省完達(dá)山乳業(yè)股份有限公司。硝酸纖維素膜，0.2μm孔徑，美國Invitrogen公司產(chǎn)品。預(yù)染蛋白質(zhì)Marker，北京天根生化公司產(chǎn)品。放射自顯影膠片，美國AmershamhamaciaBiotech公司產(chǎn)品。其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。　　1.2方法　　1.2.1益腎活血提取液制備藥物組成：枸杞、丹參、生黃芪、黃精、川芎、水蛭、瓜蔞皮、大黃、黃連。以上生藥材由　濟(jì)南建聯(lián)藥材公司提供。生藥材經(jīng)過二次干燥之后，按處方比例混勻，室溫下加入蒸餾水浸漬1h;煎煮兩次，每次煎煮1h;將過濾后的濾出液混合，之后兩次醇沉，再行水提，濃縮成含生藥1g

7、/ml的藥液，-20℃保存，稀釋使用?！　?.2.2HUVECs原代培養(yǎng)無菌獲取健康剖宮產(chǎn)婦新生兒臍帶15~20cm,剪去鉗痕，以PBS沖洗臍靜脈管腔。將臍帶的一端用止血鉗夾閉，注入0.125%胰蛋白酶消化液于超凈臺上室溫消化10~13min。用無菌空針將消化液抽出，置于離心管內(nèi)，再以PBS沖洗管腔，洗出液置于離心管內(nèi)，加入2ml胎牛血清終止消化。1000r/min,離心8~10min。于超凈臺內(nèi)將離心管內(nèi)的上清液倒掉，以全培養(yǎng)基(M199+20%胎牛血清+3%重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子+1%HEPES)將細(xì)胞懸浮，轉(zhuǎn)移至25cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)，

8、置于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)，12~24h后換液，清除未貼壁細(xì)胞，以后每3~4d換液一次。見圖1。　　1.2.3細(xì)胞傳代待原代細(xì)胞融