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《載脂蛋白e基因敲除小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、載脂蛋白E基因敲除小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化 成纖維細(xì)胞作為動脈外膜最主要的細(xì)胞成分，在環(huán)境因素發(fā)生改變時具有調(diào)整其表型的能力。在血管內(nèi)皮損傷的模型中，外膜表現(xiàn)出了顯著增厚，其主要就是由于外膜成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞聚集引起的。但是關(guān)于動脈粥樣硬化早期血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的報道甚少，本研究將通過整體動物及體外實(shí)驗(yàn)觀察載脂蛋白E基因敲除(ApoE－/－)小鼠血管外膜成纖維細(xì)胞表型的變化，探討血管外膜成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變在早期動脈粥樣硬化病灶形成中的作用?！ ?、材料與方法 1.1主要材料 6
2、周齡ApoE－/－小鼠和C57BL/6鼠購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibicol公司。兔多克隆抗體轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming groentin)抗體、抗小鼠結(jié)蛋白(desmin)抗體及抗小鼠α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscleactin，α-SM-actin)抗體購于美國NeoMarkers公司;鼠組織免疫組織化學(xué)試劑盒購于福州邁新試劑公司;兔即用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司;鏈霉親和素
3、-生物素-異硫氰酸酯(streptavidin-biotin plex-fluoresceine isothiocya-nate，SABC-FITC)及鏈霉親和素-生物素-cy3(streptavidin-biotinplex-cy3，SABC-cy3)試劑盒購于武漢博士德公司。DAPI購于美國Sigma公司?！ ?.2標(biāo)本制備 6周齡ApoE－/－小鼠和野生型C57BL/6小鼠，分別給予高脂飼料(基礎(chǔ)飼料84.75%，飽和脂肪15%，膽固醇0.25%)喂養(yǎng)2周、4周和8周。在各個時間點(diǎn)處死動物后取升主動脈
4、用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制備連續(xù)切片?！ ?.3免疫組織化學(xué)染色 選取部分切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測α-SM-actin和Vimentin的表達(dá)，按鼠組織免疫組織化學(xué)試劑盒說明書操作。按兔即用型SP免疫組織化學(xué)試劑盒說明檢測Desmin的表達(dá)。部分切片進(jìn)行免疫熒光染色檢測TGF-β1的表達(dá)，按SABC-cy3試劑盒說明書操作，顯微鏡下觀察采集圖像?！ ?.4血管外膜成纖維細(xì)胞的培養(yǎng) 6周齡野生型C57BL/6小鼠和ApoE－/－小鼠，高脂喂養(yǎng)2周后，頸椎脫臼處死，無菌開胸取出整
5、條主動脈，仔細(xì)清除血細(xì)胞及血管周圍脂肪組織，解剖顯微鏡下小心剝離外膜。用眼科剪將組織剪碎成約1mm3小塊，接種到培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2干涸培養(yǎng)2～4h待組織塊貼牢后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶繼續(xù)靜置培養(yǎng)，觀察大部分組織塊周圍爬出細(xì)胞，融合成片時，用0.25%胰蛋白酶消化并采用差速貼壁法純化兩次?！ ∵x取第3～5代細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！ ?.5免疫熒光染色檢測體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞中Vi-mentin、α-SM-actin和Desmin的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，0
6、.25%的胰酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5108cells/L，接種于帶爬片的6孔板中，靜置培養(yǎng)48h待細(xì)胞長至亞融合狀態(tài)后，血清饑餓24h，然后更換含有10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h，棄去培養(yǎng)液，取出細(xì)胞爬片。PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定20min。然后PBS沖洗3遍，3%過氧化氫室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶。之后Vimentin免疫熒光染色按SABC-FITC試劑盒進(jìn)行，α-SM-actin及Desmin免疫熒光染色按SABC-cy3試劑盒進(jìn)行?！ ?.
7、6透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5109cells/L，接種于新培養(yǎng)瓶中，后靜置培養(yǎng)48h待細(xì)胞長至亞融合狀態(tài)，血清饑餓24h，更換含10%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后收集細(xì)胞［約(15～20)106個培養(yǎng)細(xì)胞］，經(jīng)過固定、漂洗、脫水、滲透包埋與聚合、切片、染色后透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)?！ ?.7-actin及TGF-β1蛋白的表達(dá) 收集細(xì)胞加入100μL細(xì)胞裂解液，冰上孵育20min，10000g離心5m
8、in，取各組細(xì)胞的裂解液10μL，各加入5μL上樣緩沖液，混勻。水中煮沸3～5min，10000g離心1min，冰上放置，上樣。經(jīng)電泳、考馬斯亮蘭染色、脫色，轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗α-SM-actin或TGF-β1，4℃雜交過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗37℃孵育1h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色。結(jié)果作半定量分析?！ ?.8統(tǒng)計學(xué)分析 檢測結(jié)果均用x&plusm
