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《豬瘟強毒和疫苗株的環(huán)介導等溫擴增檢測方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、豬瘟強毒和疫苗株的環(huán)介導等溫擴增檢測方法 0、引言 豬瘟(classicalsediatedisothermalamplification，LAMP)是一種新型核酸擴增技術(shù)，選用4～6條特殊引物(內(nèi)向引物FIP/BIP、外向引物F3/B3和環(huán)引物LF/LB)識別靶序列6～8個特異性區(qū)域，具有極高的特異性;然后利用具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，60～65℃恒溫催化新鏈合成，從而使靶基因達到高效擴增的目的，30～60min即可獲得109靶序列拷貝．LAMP擴增產(chǎn)物為一系列序列反向重復的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜
2、樣結(jié)構(gòu)構(gòu)成的DNA片段混合物，并產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，因此可通過觀察白色沉淀、熒光染料顏色變化、凝膠電泳或斑點雜交等判定結(jié)果．因此，LAMP反應特異性強、靈敏度高、快速準確、操作簡單，同時對生物污染物的耐受性強，可有效克服PCR反應中常見酶失活的問題，在病毒、細菌、寄生蟲等病原微生物的臨床檢測中得到廣泛應用．在CSFV的LAMP檢測方面，根據(jù)豬瘟病毒5'-UTR、E2或NS5B基因保守序列設計LAMP引物，建立了檢測CSFV或HCLV的LAMP檢測方法，其敏感性比RT-PCR高10～100倍，與熒光定量PC
3、R相當，但鑒別檢測CSFV強毒和疫苗株RT-LAMP的報道還很少．因此，本文在分析CSFV全基因組序列的基礎(chǔ)上，設計CSFV強毒和疫苗株的特異性LAMP引物，分別建立了CSFV強毒和疫苗株的LAMP檢測方法，為我國豬瘟防控與凈化提供技術(shù)支撐，對動物疫病感染的鑒別檢測有重要意義． 1、材料與方法 1．1毒株 CSFV標準強毒株(shimen)由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學實驗室提供，豬瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)購自哈爾濱維科生物公司，以及實驗室保存的PRV、PCV2、PRRSV、JEV等毒株． 1．2主要
4、試劑 BstDNA聚合酶(8U)，10thermopol反應緩沖液，dNTPmixture，DL2000DNAmarker，ExTaqDNA聚合酶，Mg2+/Mn2+混合物，TRIzol，異丙醇，無水乙醇，氯仿，瓊脂糖，DEPC，羅丹明B衍生物熒光指示劑由河南省農(nóng)業(yè)科學院王德國老師惠贈． 1．3引物設計與合成 參照GenBank中登錄的CSFV標準強毒株(shimen、Alfort、Brescia、Glentorf等)，疫苗株(HCLV、ChineseC、Rimes等)、不同基因亞型的CSFV野毒株，BV
5、DV和BDV的全基因組序列，利用DNAstar軟件進行比對，系統(tǒng)比較分析豬瘟強弱毒株的序列差異，確定鑒別檢測的靶基因位于NS5B基因上，然后運用在線軟件primerexplorerv4soften株300μL至滅過菌的1．5mL離心管中，用TRIzol試劑盒提取豬瘟病毒強毒株與兔化弱毒疫苗株的RNA，然后加13μLDEPC水溶解，用于RT-PCR反應．1．4．2RT-PCR依據(jù)GenBank中CSFVNS5B基因上的一段保守序列，利用primerpremier5．0軟件設計PCR引物，進行PCR擴增
6、．先進行反轉(zhuǎn)錄，獲得CSFVRNA后再進行PCR擴增，優(yōu)化PCR循環(huán)參數(shù)，確定最佳擴增程序，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定． 1．5豬瘟強毒株與疫苗株的LAMP檢測方法的建立 LAMP反應體系為25μL:BstDNA聚合酶(8U)1．0μL，10Bstbuffer2．5μL，dNTP(10mmol/L)2．5μL，Mg2+/Mn2+混合物2μL，混合引物(F3、B3:5μmol/L;FIP、BIP:40μmol/L;LF、LB:20μmol/L;將稀釋好的引
7、物等體積混合)共6．0μL，CSFV模板cDNA2．0μL，羅丹明B染料1μL，滅菌雙蒸水8．0μL．在上述LAMP反應體系基礎(chǔ)上設置不同的反應溫度(61℃，63℃，65℃)，選擇豬瘟強毒株與疫苗株的最佳作用溫度;和不同的恒溫作用時間(20min，30min，40min，50min，60min)，選擇豬瘟強毒株與疫苗株最佳反應時間． 1．6LAMP特異性檢測 用PRV，PCV2，PRRSV，JEV，CSFV的DNA或cDNA分別為模板，按照建立的LAMP反應體系和優(yōu)化的反應條件進行擴
8、增，擴增結(jié)束后80℃加熱2min，取5μL核酸產(chǎn)物做2%瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定LAMP擴增的特異性． 1．7LAMP敏感性檢測 將提取的CSFV強毒株與疫苗株cDNA分別用滅菌雙蒸水做10倍倍比稀釋(101，102，103，104，105，106，107，108，109，1010)，然后分別做為模板，按照建立的LAMP反應體系和優(yōu)化的反應溫度和時間進行擴增，擴增結(jié)束后80℃加
